中国罗非鱼主养区无乳链球菌流行菌株的菌毛岛屿及其血清型分型

为了解近年来中国罗非鱼主养区无乳链球菌流行特征,本研究通过PCR扩增和测序等方法对2007年~2016年分离纯化得到的263株罗非鱼无乳链球菌进行菌毛岛屿和血清型分型分析。菌毛岛屿分型结果显示:263株罗非鱼无乳链球菌可分为两种菌毛岛屿类型:PI-2b型(40株)和PI-1+PI-2b型(218株),其中PI-1+PI-2b型无乳链球菌是主要的流行菌株,占总数的82.9%。其余5株无乳链球菌的菌毛岛屿基因缺失,不含菌毛岛屿。分子血清型分析结果显示,所有的无乳链球菌分为两种血清型:Ia型258株(98.1%)和Ib型5株(1.9%)。所有Ib型无乳链球菌的菌毛岛屿均有缺失,仅含有2b-AP1基因。进一步分析表明,Ia-(PI-2b)型无乳链球菌是2011年之前主要的流行株型,而Ia-(PI-1+PI-2b)型无乳链球菌为近6年来广泛流行的株型。Ia型是我国罗非鱼无乳链球菌最流行的分子血清型,同时PI-2b是最重要的菌毛岛屿(98.1%)。本研究为罗非鱼无乳链球菌的流行病学和疾病防控提供调查依据。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、BP、AP2三基因的串联表达及其免疫原性研究

为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。

科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿AP2基因部分片段克隆及其抗原性预测

【目的】克隆分析科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿AP2基因片段,为深入研究奶牛乳腺炎无乳链球菌免疫机制及制备新型免疫抗原提供理论依据。【方法】根据Gen Bank已公布牛源无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿的AP2基因序列,采用Primer 5.0软件设计1对特异性引物,以内蒙古通辽地区乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板,扩增AP2基因片段,并分析其编码序列及免疫活性。【结果】科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿AP2基因片段大小为699 bp,共编码233个氨基酸残基,其基因序列与Gen Bank已公布牛源无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP2基因序列(EU930008)的相似性达99.6%,仅有3个碱基出现变异(402C→A、563C→T和467A→T)。菌毛岛屿辅助蛋白AP2二级结构的α螺旋在C端分布较多;β折叠较丰富,且分布均匀;而无规则卷曲分布在两端。菌毛岛屿辅助蛋白AP2的亲水区分布较广,几乎遍布于整个蛋白区,属于亲水性蛋白;其抗原指数较高的区段较丰富,抗原性良好;蛋白质分子表面可及性也较高,其区域占比达54.0%。【结论】科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿AP2基因具有高度保守性,其编码蛋白具有良好的抗原性,可作为阻止无乳链球菌感染的候选疫苗靶标抗原。

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿rAP1-BP-AP2重组蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立了奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体的间接ELISA检测方法。优化后抗原的最佳包被量为5.0μg/孔,血清样品最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶5 000。对S.agalactiae、S.pyogens、E.coli、S.aureus、S.epidermidis阳性血清进行检测结果显示,后4种阳性对照血清未出现阳性反应,表明该方法具有良好的特异性;对已知牛无乳链球菌阳性血清倍比稀释后进行检测时,当稀释倍数达到1:12 800时仍出现阳性结果,表明该方法具有较高的敏感度;重复性试验显示批内变异系数为2.41%~8.89%,批间试验变异系数为7.53%~10.46%;用该方法对426份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,结果显示,其样品阳性检出率为45.07%。本研究首次基于乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿三联重组蛋白建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种准确、可靠的检测方法。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿亚基不同组合融合抗原对BALB/c小鼠免疫保护性实验

为评价牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿亚基不同组合融合蛋白AP1-AP2、 AP1-BP、 BP-AP2、AP1-BP-AP2对BALB/c小鼠的免疫保护性,本研究取各融合蛋白与同体积的弗氏佐剂进行乳化,分别制备融合抗原免疫制剂,4种免疫制剂均以50μg/只对小鼠进行4次免疫后均产生了较高滴度的抗体,其中AP1-BP-AP2融合抗原产生的抗体滴度水平最高,可达1∶25 600。在免疫后第50 d时利用104 cfu/mL乳腺炎无乳链球菌攻毒,每天观察记录小鼠的精神状态、食量变化等生理状态。攻毒试验结果显示,4种不同融合抗原均显示不同程度的免疫保护性,其中AP1-BP-AP2融合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护性为最佳,其免疫保护指数PI达到80%。本研究首次创新性地开展牛乳腺炎无乳链球菌Ia亚型PI-2a菌毛岛屿AP1、AP2、BP亚单位不同组合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护试验,获得了AP1-BP-AP2融合抗原的免疫保护效果为最佳的结论,为进一步开发无乳链球菌性乳腺炎防控的亚单位疫苗及其流行病学检测试剂盒提供了实验依据。

牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿辅助蛋白AP1基因的克隆及其表达产物的抗原性鉴定

目的克隆与高效表达无乳链球菌细胞表面菌毛岛屿辅助蛋白AP1基因编码蛋白抗原优势区,并进行抗原性分析及鉴定。方法根据GenBank上公布的牛乳腺炎无乳链球菌辅助蛋白AP1(EU929387.1)基因序列,利用生物信息学学软件Primer5.0和DNA MAN,根据其辅助蛋白保守序列设计、合成1对克隆引物,以分离于内蒙古东部地区乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板,PCR扩增辅助蛋白AP1基因序列,经克隆与测序后构建重组表达载体AP1-pET30,转化大肠埃希菌BL21,并进行高效表达,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。结果克隆的抗原表位序列片段大小为714bp,编码238氨基酸残基,与GenBank公布的AP1(EU929387.1)基因序列相似性为99.72%,氨基酸残基相似性为99.58%。构建的重组表达载体经诱导表达可溶性蛋白,纯化后重组蛋白的纯度>95%,Western blot分析重组蛋白能被牛源无乳链球菌阳性血清识别。结论成功构建了pET-30a-AP1重组表达载体,该载体能可溶性表达重组蛋白,表达产物具有良好抗原反应性,为进一步研究辅助蛋白AP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定奠定了实验基础。

奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a骨架蛋白BP基因的克隆及其抗原性预测

目的克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿BP基因片段并进行序列分析。方法根据GenBank已公布牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的BP基因序列,采用Primer 5.0软件设计1对特异性引物,以内蒙古通辽地区分离的乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板PCR扩增BP基因片段,并进行生物信息学分析。结果克隆的BP基因序列大小为609bp,编码203个氨基酸残基,其基因序列与GenBank上公布的牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的BP基因(EU930008)相似性为100%。菌毛岛屿骨架蛋白BP二级结构的α螺旋在N端分布较多;β折叠较丰富,且分布于C端较多;无规则卷曲分布较均匀。菌毛岛屿骨架蛋白BP的亲水区分布较广,遍布于整个多肽区,属于亲水性蛋白。BP蛋白分子表面可及性较高,区域占比达57.0%,且抗原性较好。结论奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛骨架蛋白BP基因具有高度保守性,其编码蛋白具有良好的抗原性,可作为防治无乳链球菌性乳腺炎的候选抗原序列。

奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a骨架蛋白BP基因的克隆及其序列分析

目的获得通辽地区奶牛乳腺炎致病菌无乳链球菌相关菌毛岛屿BP基因序列并进行比对分析。方法根据DNAMAN分析基因库中牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的BP基因序列设计1对特异性引物,以无乳链球菌通辽分离株总DNA为模板,PCR扩增BP基因片段并进行序列比对分析。结果获得了菌毛岛屿PI-2a的BP基因序列,目的基因为609bp,编码203个氨基酸,其基因序列与GenBank上公布的牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的BP基因(EU930008)同源性为100%。BP蛋白二级结构的α螺旋在N端分布较多,β折叠较丰富且分布C端较多,无规则卷曲分布较均匀。BP蛋白的亲水区分布较广,遍布于整个蛋白区,属于亲水性蛋白。BP蛋白分子表面可及性较高,区域占比达57.0%,且具有抗原性。结论获得了奶牛乳腺炎无乳链球菌通辽分离株菌毛岛屿PI-2a骨架蛋白BP基因序列,该基因序列具有高度保守性,其编码蛋白具有抗原表位,可作为奶牛无乳链球菌重组基因工程疫苗候选亚单位抗原。

牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白AP2基因的克隆及序列分析

目的克隆牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白AP2基因,并进行序列分析。方法根据GenBank公布的牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的AP2基因序列,使用生物信息学软件Primer5.0设计1对特异性引物,以内蒙古东部地区乳源无乳链球菌临床菌株总DNA为模板,扩增AP2基因片段。结果扩增的AP2基因经克隆测序,长度为699bp,其序列与GenBank上公布的牛源无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a的AP2基因(EU930008)相似性为99.57%,编码233个氨基酸残基,有2个核苷酸出现突变,但是氨基酸序列没有发生改变,属于无意义突变。结论成功克隆出内蒙古东部地区牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP2基因,为进一步研究AP2基因编码蛋白的抗原性奠定了基础。

科尔沁牛乳腺炎临床分离无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白2基因的克隆及序列分析

目的克隆内蒙古东部地区科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白2(ancillary protein 2,AP2)基因片段,并进行序列分析。方法根据Gen Bank中登录的牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因序列,使用生物信息学软件Primer 5.0设计1对特异性引物,以内蒙古东部地区乳源性无乳链球菌临床菌株总DNA为模板,扩增AP2基因片段,与p MD18-T Vector连接,转化至感受态E.coli JM109中,提取质粒,进行PCR及单、双酶切鉴定;将质粒p MD18-T-AP2转化感受态E.coli JM109后,利用DNAStar分析测序结果,并对其推导的氨基酸序列进行抗原可及性分析,Prot Scale在线程序分析其疏(亲)水性。结果质粒p MD18-T-AP2经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;扩增的AP2基因序列长度为699 bp,编码233个氨基酸残基,与Gen Bank中登录的无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因核苷酸序列相似性达99%,有3个碱基出现变异(402:C→A;563:C→T;467:A→T),氨基酸序列有两处出现变异,分别为178氨基酸(V→A)和216氨基酸(E→V);该序列二级结构α螺旋分布C-末端较多,β折叠较丰富,分布较均匀,无规则卷曲分布在两端,亲水性指数相对较高,抗原性较好。结论成功克隆出内蒙古东部地区科尔沁牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a AP2基因,为进一步研究AP2基因编码蛋白的抗原性奠定了基础。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白BP、AP2主要抗原域的串联表达及其免疫活性

目的构建无乳链球菌(group B Streptococcus agalactea,GBS)菌毛岛屿辅助蛋白BP、AP2主要抗原表位域融合表达重组质粒,进行高效表达,并分析其免疫活性。方法利用DNAstar生物信息软件Protean功能筛选BP和AP2主要抗原表位域,并引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术扩增融合BP、AP2主要抗原表位域基因,PCR扩增串联体基因片段,克隆至原核表达载体p ET-30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)/BP+AP2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白BP+AP2经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并免疫昆明小白鼠,检测其免疫原性。结果 PCR扩增出675 bp的BP和759 bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 380 bp的BP、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达质粒经诱导后获得表达,目的蛋白相对分子质量约55 000,主要以包涵体形式存在,纯化后纯度达96%以上,浓度为2.05 mg/ml。纯化的融合蛋白能被兔抗GBS阳性血清所识别,且具有良好的免疫原性。结论构建了GBS BP、AP2主要抗原表位域串联体重组表达质粒p ET-30a(+)/BP+AP2,表达产物具有良好的免疫活性,为进一步研究基于BP、AP2蛋白的致病机制、诊断制剂及基因工程疫苗奠定了基础。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、BP主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定

目的构建无乳链球菌菌毛岛屿辅助蛋白AP1、菌毛骨架蛋白BP主要抗原域串联表达重组载体,对表达产物进行抗原性分析及鉴定。方法利用DNAstar Protean功能筛选AP1和BP主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、BP主要抗原决定簇基因区,PCR扩增串联体基因片段,克隆至pET-30a(+)载体后转化BL21(DE3)细胞,表达的目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。结果 PCR扩增出321bp的AP1和660bp的BP主要抗原域,经重叠延伸PCR获得966bp的AP1、BP串联体基因片段,DNA测序表明无碱基缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经IPTG诱导能可溶性表达分子质量约45ku的目的蛋白,纯化后重组蛋白的纯度≥95%,Western blot分析表明,重组融合蛋白能被兔源抗无乳链球菌阳性血清识别。结论重叠延伸PCR获得AP1、BP主要抗原域串联体,构建的pET-30a(+)/AP1+BP重组表达载体能以包涵体形式表达目的蛋白,表达产物具有良好的反应原性,为研究基于AP1、BP蛋白的致病机制及其免疫活性奠定了实验基础。

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、AP2主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定

利用DNAStar Protean功能筛选AP1和AP2主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、AP2主要抗原域基因,PCR扩增串联体基因片段,将其克隆至pET-30a（＋）载体,转化BL21（DM3）细胞,进行高效表达,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。PCR扩增出320bp的AP1和759bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 065bp的AP1、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经诱导能够可溶性表达,目的蛋白相对分子质量大小约46 000,纯化后重组蛋白的纯度〉96%,Western blot分析重组融合蛋白结果表明,能够被兔源抗无乳链球菌阳性血清所识别。重叠延伸PCR获得了AP1、AP2主要抗原域串联体,构建了pET-30a（＋）/AP1＋AP2重组表达载体,诱导目的蛋白呈可溶性表达,表达产物具有良好的免疫反应原性,为进一步研究基于AP1、AP2蛋白的致病机制,检测制剂及疫苗奠定了试验基础。