F4ac型产肠毒素大肠杆菌菌液上清对仔猪小肠上皮细胞的免疫刺激作用

【目的】猪源产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一类世界范围内流行的致仔猪腹泻的病原菌。依据养猪业生产实践中对致仔猪腹泻病原菌血清学鉴定结果可知,F4ac型ETEC的流行性最为广泛。到目前为止,对ETEC导致仔猪腹泻的机理已经有了比较透彻的阐释。但对ETEC培养液的免疫原性尚未有研究和描述。论文以F4ac型ETEC为研究对象,探索其菌液上清(即培养液)对仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的免疫刺激作用。【方法】首先收集F4ac型ETEC菌株200培养12h后的培养液,后经4℃,4 000 r/min,离心15 min收集培养液上清,将该上清液经0.22μm滤器过滤,并与DMEM/F12培养基以1﹕1的比例混合,以此混合液共孵育IPEC-J2细胞3 h,重复此处理3次获得处理组细胞;同时设新鲜的LB培养基与DMEM/F12培养基同样以1﹕1的比例共孵育3 h的IPEC-J2细胞为对照组细胞,对照处理亦重复3次。然后用TRIZOL试剂按照说明书提取对照组和攻毒组IPEC-J2细胞的总RNA,并用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(反转录试剂盒)按照说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。应用文献报道或自行设计的跨内含子的引物通过实时荧光定量PCR方法,以猪的持家基因β-actin作为内参,检测IL8、TNF-α、CXCL2、IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13共9个免疫相关基因和黏蛋白基因在攻毒组和对照组中的mRNA表达差异性。【结果】较之对照组,在攻毒组中,3个重要的促炎细胞因子基因IL8、TNF-α和CXCL2的mRNA均出现了显著性地过表达。其中,在攻毒组中,IL8的表达量为对照组的3.24倍(P<0.05);TNF-α的表达量亦为对照组的3.24倍(P<0.01);CXCL2的表达量为对照组的1.65倍(P<0.001)。在攻毒组和对照组之间,其他6个基因(IL6、IL1A、TLR4、SLPI、PLAU和MUC13)的表达差异未达到统计学上的显著水平。【结论】研究采用F4ac型ETEC菌株200的培养液上清对IPEC-J2细胞系进行3 h攻毒处理,并通过荧光定量PCR方法检测到了3个重要的促炎因子基因IL8、TNF-α和CXCL2在攻毒组较之非攻毒组中的过表达。这表明猪F4ac型ETEC培养液上清对仔猪小肠上皮细胞确实具有一定的免疫刺激作用。研究为更明确地了解猪F4ac型ETEC释放的肠毒素及黏附素等抗原物质对仔猪小肠上皮细胞的免疫刺激作用提供了一定的实验证据。

食用酸枣仁多糖的小鼠肠道菌群培养上清液对Caco-2细胞吸收相关蛋白表达的影响

为了探究食用酸枣仁多糖(ZSSP)的小鼠肠道菌群培养上清液是否会调节Caco-2细胞中外排转运蛋白、紧密连接蛋白和Ⅱ相代谢酶的表达水平。将20只C57BL/6小鼠随机分为对照组和ZSSP组,分别灌胃超纯水和酸枣仁多糖水溶液(100 mg/kg·d^-1)14 d,收集小鼠粪便制备肠道菌群培养上清液。采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测肠道菌群培养上清液对Caco-2细胞活力的影响,采用免疫印迹(western blot,WB)法检测Caco-2细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)、咬合蛋白(Occludin)和闭合蛋白1(Claudin-1)的表达水平,用酶联免疫检测(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒测定磺酸基转移酶(sulfotransferase,SULT)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)的含量。结果表明,ZSSP组的肠道菌群培养上清液能显著降低Caco-2细胞中外排转运蛋白(P-gp和MRP2)的表达水平(P<0.05),显著升高UGT的表达水平(P<0.05),但对紧密连接蛋白(Occludin和Claudin-1)和SULT没有显著影响(P>0.05)。由此可知,食用酸枣仁多糖的小鼠肠道菌群培养上清液能调节Caco-2细胞中的外排转运蛋白和Ⅱ相代谢酶的表达水平。

罗伊氏乳杆菌NCU801的鉴定及抑菌性能研究

从乳猪粪便中筛选出1株乳酸菌,经生理生化和分子生物学鉴定,该菌株为罗伊氏乳杆菌,命名为罗伊氏乳杆菌NCU801。采用牛津杯法,分别对其发酵液、发酵液的无菌上清液、发酵液的菌体进行体外抑菌性能研究。结果表明,NCU801发酵液对大肠埃希氏菌CMCC444的抑制作用最强。进一步研究无菌上清液经热处理、p H调节、氯仿和酶处理后对大肠埃希氏菌CMCC444的抑菌活性的影响,考察无菌上清液对大肠埃希氏菌生长的影响。结果显示,温度、酶对无菌上清液的抑菌效果无显著影响;p H接近中性时,抑菌效果减弱;氯仿抽提后显示,无菌上清液中的抑菌物质全部是水溶性物质;且无菌上清液能显著性的影响大肠埃希氏菌的生长。

颊纤毛菌对变异链球菌产酸及黏附作用的影响

目的:研究分别使用颊纤毛菌(L.buccalis)及其上清液与变异链球菌(S.m)共培养,观察S.m的产酸、黏附变化及乳酸脱氢酶(ldh)、葡糖基转移酶(gtfb、gtfc、gtfd)基因表达变化。方法:首先从龈上菌斑中分离口腔L.buccalis,采用生化鉴定和测序鉴定;将L.buccalis单独培养组、S.m单独培养组、L.buccalis与S.m共培养组和S.m加入L.buccalis上清液培养组均培养9 h,比较每小时各组细菌产酸能力的变化;再将L.buccalis单独培养组、S.m单独培养组、分别加入1、2、3 mL L.buccalis菌液的S.m共培养组和分别加入1、2、3 mL L.buccalis上清液的S.m菌液培养组,用实时定量RT-PCR法测定各组ldh、gtfb、gtfc和gtfd的基因表达;在S.m中分别加入50、100、150μL L.buccalis上清液培养,在激光共聚焦显微镜下观察S.m黏附数量变化。结果:本实验成功分离L.buccalis,S.m中加入L.buccalis或L.buccalis上清液培养后pH下降速率增快,细菌的黏附数量增多,且随L.buccalis或L.buccalis上清液体积的增加ldh、gtfb、gtfc和gtfd的基因表达增高。结论:L.buccalis及其上清液对S.m的产酸及黏附能力具有促进作用。