白念珠菌菌相转换基因HYR1上游N-乙酰葡萄糖胺激活序列的初步定位

目的:对白念珠菌菌相转换基因HYR1上游N-乙酰葡萄糖胺激活序列进行初步定位,探讨菌相转换可能的调控机制。方法:DNAssist 2.0软件分析HYR1基因上游1 800 bp内可能的N-乙酰葡萄糖胺激活序列片段,选择-1 800^+43bp、-1 400^+43 bp、-1 000^+43 bp、-600^+43 bp-、400^+43 bp-、200^+43 bp这些区域作为分析目标,PCR扩增这些片段,将其分别克隆至含β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因的载体PNG17中构建质粒重组体,分别命名pHYR1.8、pH-YR1.4、pHYR1.0p、HYR 0.6、pHYR0.4、pHYR0.2,测序确认后转化酵母菌EGY48,培养含有不同重组体的酵母转化子,将不同的酵母转化子接种于含有N-乙酰葡萄糖胺和β-半乳糖苷(X-gal)的培养基上,在不同条件下观察培养基的颜色变化。结果:成功构建6种重组体pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR 0.6、pHYR0.4、pHYR0.2,经测序,插入片段与预期序列完全一致。酵母菌转化子生长良好,在N-乙酰葡萄糖胺作用下,含pHYR1.8和pHYR1.4的转化子使培养基成蓝色,含其他重组体pHYR1.0p、HYR 0.6、pHYR0.4、pHYR0.2的转化子不使培养基显色。结论:N-乙酰葡萄糖胺可能通过HYR1上游-1 400^-1 000 bp区域内的启动元件激活HYR1基因诱导白念珠菌菌相转换。

运用3′RACE验证LongSAGE文库构建后白念珠菌不同菌相的差异表达基因

目的 鉴定从LongSAGE文库筛选到的白念珠菌不同菌相表达基因差异表达标签JMD8和JSW10所代表基因。方法 诱导白念珠菌菌丝相的表达后,运用3′RACE技术扩增白念珠菌差异表达基因标签基因片段,纯化回收后,T/A连接,经氯化钙法转化大肠杆菌,X gal/IPTG诱导表达,在阳性菌株中抽提质粒后酶切、测序。结果 两个片段均能在GenBank中找到同源序列,Score值小于40 ,Evalue小于0 5。结论 鉴定了白念珠菌LongSAGE标签JMD8和JSW 10代表的基因分别为EFT2和SHMII。