菌落杂交法鉴定沙门菌第一类整合子

目的:建立一种快速而经济的鉴定细菌中整合子的新方法,分析整合子介导的细菌耐药性。方法:以第一类整合酶基因intI1为探针,采用地高辛进行标记,菌落杂交的方法来鉴定第一类整合子阳性菌株。结果:发现在23株沙门菌中,四株第一类整合子阳性菌株,与采用第一类整合酶基因intI1 PCR扩增方法所得到的结果相一致。结论:菌落杂交法可以简单快速地鉴定细菌中整合子,这对研究整合子的特性及整合子在细菌耐药性中的介导作用具有重要意义。

菌落杂交法检测产毒性大肠杆菌

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是新发展的试管内DNA扩增技术,它在病原体检测中有二方面的应用:1.PCR直接检测;2.PCR产物制备探针,杂交法测定。我们已成功地建立了PCR法检测ETEC毒素基因。本文试用^(32)

致病性副溶血性弧菌菌落杂交检测体系的优化

对常见食源性致病菌副溶血性弧菌的杂交条件进行了优化。基于副溶血性弧菌的tdh,trh,toxR基因选用了3种探针序列,从菌落杂交样品的预处理方法、杂交时间和显色检测等方面对基于副溶血性弧菌毒力基因的原位杂交实验进行了条件优化。结果表明,采用80℃热固定2 h,37℃预杂交10 min后杂交8 h以及封闭1 h的改良方法可获得高特异性、低背景且着色清晰的实验结果。优化的菌落杂交技术检测副溶血性弧菌与传统检测方法相比,具有高效、准确、可区分致病性菌株的优点,为水产品中副溶血性弧菌致病菌株和非致病菌株的同步检测和筛选提供参考。

富集文库—菌落原位杂交法筛选栉孔扇贝的微卫星标记

应用微卫星富集文库——菌落原位杂交法，筛选得到了40个栉孔扇贝的微卫星标记。用固定了（AG）15和（AC）15探针的尼龙膜（HybondN^＋）捕捉含有微卫星DNA的片段，经洗脱、PCR扩增和TA克隆，构建栉孔扇贝的微卫星富集文库。利用ECL试剂盒（Amersham公司）标记的（AG）15和（AC）15探针进行菌落原位杂交筛选微卫星富集文库，阳性克隆经测序获得微卫星DNA。富集文库中1200个重组克隆经过菌落原位杂交后，532个（44．3％）为阳性克隆。任意挑选100个克隆测序，结果显示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点。利用软件设计了65对特异性PCR引物，40对能扩增出清晰的带谱；利用48个栉孔扇贝个体评价微卫星位点，分析表明37个位点具有多态性。不同的位点获得的等位基因数目为2～14个不等，37个多态性位点共获得258个等位基因，平均每个位点获得7．0个等位基因。观测杂合度（H0）、期望杂合度（HP）及多态性信息含量值（P配）的范围分别为0．1000-1．0000、0．1197-0．9831和0．1172-0．9782。结果表明，富集文库一菌落原位杂交法适合大规模筛选目标物种的微卫星标记。

菌落原位杂交法检测革兰阴性菌Ⅰ类整合子的研究

目的用菌落原位杂交法检测革兰阴性菌中Ⅰ类整合子。方法制备Ⅰ型整合酶基因的特异性探针,采用菌落原位杂交法检测革兰阴性菌中的Ⅰ型整合酶基因,并与PCR的检测结果比较。结果40株多重耐药的革兰阴性菌中,经菌落原位杂交法检测出有18株含Ⅰ类整合子,另外22株杂交结果阴性,与PCR法检测结果一致。结论菌落原位杂交法可替代PCR法检测革兰阴性菌Ⅰ型整合酶基因。

改良菌落原位杂交技术快速筛选NDVF基因阳性克隆株

应用从表达型质粒载体构建的ＮＤＶＦ基因文库中筛选阳性克隆株的改良融合蛋白质抗体蛋白质原位杂交技术，可使菌落在硝酸纤维素薄膜上增殖，经适当处理后，即可用特异性抗体探针进行原位筛选，获得含目的基因编码的特异抗原蛋白的阳性克隆株。

菌落原位杂交法筛选特定菌种的方法初探

菌落原位杂交法是重组DNA技术中最常用的方法之一,但该方法存在着杂交背景复杂及杂交结果不稳定性等缺点,所以进一步优化杂交体系显得尤为迫切。本研究通过优化杂交体系,最终确定利用溶菌酶处理杂交膜和采用非严紧型洗脱方式洗膜,不仅使得杂交体系的杂交结信号清晰,而且杂交背景较干净。研究结果表明,在探针特异性好的基础上,采用优化的菌落原位杂交体系筛选特定菌种是可行的。

菌落原位杂交技术在环境微生物检测中的应用

微生物技术在处理环境污染物等方面具有成本低、无二次污染、反应条件温和等优点。为从根本上解决环境问题,就环境中微生物的检测为主题,介绍了菌落原位杂交的原理以及在环境微生物检测中的应用。

富集文库-菌落原位杂交法筛选仿刺参微卫星标记

应用微卫星富集文库—菌落原位杂交的方法,筛选得到了33个仿刺参的微卫星标记。富集文库中900个重组克隆经过菌落原位杂交后,415个(46.1%)为阳性克隆。随机挑取100个阳性克隆进行测序,结果显示这些克隆都含有微卫星位点。设计了57对特异性PCR引物,33对能扩增出清晰的条带。利用48个野生仿刺参个体对33个微卫星位点进行评价,结果显示位点都具有多态性。33个多态位点共获得222个等位基因,平均每个位点获得6.7个等位基因。观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的范围分别为0.050 0~1.000 0和0.203 2~0.915 9。结果表明,富集文库—菌落原位杂交法筛选微卫星标记比较高效,获得的微卫星标记可以用于仿刺参的分子遗传学研究。

优化菌落原位杂交体系筛选野生稻基因组文库

菌落原位杂交仍是当今筛选基因组文库的重要方法之一,但难以保持背景清晰和阳性杂交点明显的稳定的杂交体系.通过对杂交膜不同处理方法的对比,表明利用溶菌酶处理杂交体系进行菌落原位杂交筛选,其杂交结果背景较干净,且能根据杂交信号的强弱很清晰地显色阳性黑点.采用该法筛选野生稻基因组文库,已筛选出22个阳性克隆,并测序分析均为阳性克隆.

用生物素标记DNA探针进行菌落原位杂交

将生物素标记的DNA探针用于菌落原位杂交,结合链霉菌抗生物素蛋白和生物素碱性磷酸酶系统检测显示信号。结果证明该法快速方便,杂交信号清晰,高度特异,完全可以取代同位素用于细菌分析和克隆筛选。

一种简便有效的菌落原位杂交法

本方法采用国产定量滤纸代替硝酸纤维素膜进行菌落杂交筛选。省去了真空烤膜和预杂交操作。末端标记的寡核苷酸探针杂交所得结果具有较好的特异性和较强的放射活性。

用地高辛配基标记DNA探针进行菌落原位杂交

用地高辛配基标记DNA探针,结合酶联免疫反应检测显示信号。建立了一种简便,快速的菌落原位杂交新方法。结果证明该方法敏感、稳定,完全可取代同位素用于细菌分析和克隆筛选。

用DNA杂交技术检测临床分离株的四种耐四环素基因

采用DNA杂交技术对来自我国几个省的306株革兰氏阴性杆菌携带的耐四环素基因(Tet)的分布进行了研究。所有菌株均用15种生化反应数码分析法判定,绿脓杆菌用双歧法鉴定。用四种Tet探针检测结果如下:TetB占31.4%,TetD占25.2%TetA占12.5%,TetC占10.5%。与四种探针均不杂交者占36.6%。含1种基因的菌株占51.3%,含2种的占7.5%,含3种的占2.9%,含4种的占1.6%。不同地区的菌株的Tet种类不完全相同。还发现在严格控制的条件下杂交,TetA和TetC有交叉反应。

牙鲆微卫星标记的筛选及群体多态性分析

以牙鲆(Paralichthys olivaceus Temminck et Schegel)为材料,基因组DNA经Sau3A Ⅰ进行部分酶切后,选取400～1 200bp大小的片段连接到经BamHⅠ酶切的pUC19质粒中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,构建牙鲆酶切片段基因组文库.采用菌落杂交的方法,以(AC)10、(AG)10为探针从文库中筛选阳性克隆16个,共得到20个微卫星序列,其中完全型13个,不完全型5个,复合型2个.对其中18个进行引物设计,有11对引物扩增出目的片段,其中8对引物在群体中具有扩增多态性.在威海野生牙鲆30个个体中,各座位上得到的等位基因数为4～19个,观测杂合度(Ho)为0.413 8～0.965 5.其中有3对引物扩增的等位基因数超过17个,表现出高度多态性.本研究旨为进一步的牙鲆遗传多样性分析、家系分析及遗传图谱的构建等提供基础依据.

疏水网格滤膜技术检测食源性致病菌的研究进展

疏水网格滤膜技术利用膜的疏水性黏附细菌细胞,通过膜的过滤作用截留细菌细胞,然后将膜进行选择性培养,达到检测鉴定待测菌的目的。主要概述了疏水网格滤膜技术的原理和特点,以及该技术与分子生物学技术、免疫学技术偶联在食源性致病菌检测中的应用。

东乡野生稻NBS-LRR类抗性基因同源序列的分离与鉴定

基于植物的抗性基因具有保守序列,根据已克隆基因的保守序列设计探针,利用菌落杂交的方法,对东乡野生稻大片段基因组文库进行筛选,得到两个候选克隆。序列比对发现其中含有NB-ARC的保守序列,可用于后续转基因鉴定。

双歧杆菌地高辛标记寡核苷酸基因探针制备和应用研究

目的探讨地高辛标记寡核苷酸基因探针应用于微生态研究的可行性和实用性。方法制备双歧杆菌属和部分种的地高辛标记16S rRNA寡核苷酸探针,初步应用于微生态制剂鉴定和临床肠道微生态检测,评价寡核苷酸探针杂交在肠道微生态研究和检测中的应用价值。结果地高辛标记寡核苷酸探针具有较好的特异性与灵敏度:地高辛标记的双歧杆菌属和种的共6种寡核苷酸基因探针与标准菌株杂交后灵敏度和特异度分别为属探针95%、75%,青春双歧87.5%、90%,两歧双歧87.5%、87.5%,短双歧87.5%、92.5%,婴儿双歧75%、95%,长双歧75%、100%。结论寡核苷酸基因探针用于肠道细菌的鉴定显示出一定前景,加大探针的种类与扩大调查范围有可能使该技术替代现有细菌培养技术。

东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选

目的从东方田鼠的部分BAC文库中筛选微卫星。方法应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记。结果以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆。再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55%。选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性。结论成功且高效地从阳性BAC克隆中筛选出微卫星序列,这些微卫星和阳性BAC克隆可用于后续的定位研究。

胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌（APP）体内表达的基因进行了初步筛选。将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合．分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21（DE3）的全菌及全菌裂解物进行吸附。用ELISA方法检测吸附效果，经吸附后血清D150nm分别由原来的0．927和0．239降低为0．196和0．078。同时,将APP1基因组DNA以Bsp143I进行酶切，回收500～2000bp的片段，与pET30a／b／c载体连接，构建了APP1基因组质粒表达文库，库容量（CFU）为2．0×10^5。用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库，从3000个菌落中获得了12个阳性克隆。