贵州南方菜豆花叶病毒的ELISA检疫

采用ELISA间接法对分布于贵州几个地区的菜豆进行南方菜豆花叶病毒的检测 ,结果表明 :在所采集到的样品中 ,仅贵阳地区的菜豆感染有南方菜豆花叶病毒。其检测的灵敏度和最佳反应稀释度分别为 80 6ng/mL和 1∶5 0 0稀释度。

MAP-H_2O_2-HRP伏安酶联免疫分析测定南方菜豆花叶病毒

提出间氨基酚 ( MAP) -H2 O2 -辣根过氧化物酶 ( HRP)伏安酶联免疫分析新体系 ,并用于南方菜豆花叶病毒 ( SBMV)的测定 .以线性扫描二阶导数伏安法检测 HRP催化 H2 O2 氧化 MAP的产物 ,用于游离 HRP及 SBMV的测定 ,灵敏度均高于经典的 ELISA显色光度法 .本法对 HRP测定的线性范围为 1 .0× 1 0 - 8～1 .0× 1 0 - 6 g/L,检测限为 3 .8× 1 0 - 9g/L;对 SBMV测定的线性范围为 4 .0～ 50 0 0 ng/m L,检测限为 4 .0ng/m L.用所建立的方法测定病毒感染病叶澄清液的最高稀释比为 1∶ 1 .5× 1 0 5 ,并与现行的 ELISA显色光度法进行对照 。

南方菜豆花叶病毒单克隆抗体的初步研究

南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)是一种既能通过种子远距离传播,又有介体带毒扩散力的危险性病毒。目前,国内尚未发现.SBMV主要危害菜豆、豇豆等在我国种植面积大、范围广的豆科植物。随着进出口贸易和种质交换日益增多,此病毒传入机会大大增加。为了提高检疫技术水平,了解病毒特性和建立快速检测技术,本文对SBMV单克隆抗体进行了初步研究。

RT-PCR检测南方菜豆花叶病毒

根据南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）两株系Ｂ和Ｃ的核酸序列设计两对引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ可以特异地区分纯化的和０．２ｇ病叶中的两株系，ＲＴ－ＰＣＲ检测ＳＢＭＶ－Ｂ的灵敏度为１０ｐｇ。

昆明郊区菜豆花叶病毒的电子显微镜观察

昆明郊区有50％以上的菜豆程度不同地感染上了花叶病,而且发病率有上升趋势。一般发病的菜豆减产10％～20％,严重发病的减产50％以上甚至绝收。发病症状主要表现为叶片出现黄色与深绿色相间的花叶,或叶面粗糙、皱缩、起疱斑等,全株呈矮缩及丛缩现象,株型矮小,苗期感染容易造成豆苗枯死,后期感染使结荚少而小。在云南省农科院蔬菜试验地内采集表现花叶的小黄金豆病叶,剪碎,加同等重量的0.02MPBS(pH7.0),磨细,少量汁液用磷钨酸钠负染后,JEM-100CXⅡ型电镜观察,其余汁液作为种毒用于接种。

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。

大豆种传南方菜豆花叶病毒和烟草环斑病毒的GICA-RT-PCR检测

南方菜豆花叶病毒(south bean mosaic virus,SBMV)和烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus,TRSV)是我国重要的进境检疫性有害生物,两种病毒均为种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究以这两种病毒的大豆病种子为试材,先用胶体金免疫层析试纸条(GICA)检测,将检测完病毒后的胶体金免疫层析试纸条上的T线和C线剪下,再用RT-PCR的方法将T线和C线上捕获的病毒直接进行扩增,这种将血清学与分子生物学相结合起来所建立的GICA-RT-PCR检测方法,省去了烦琐的总RNA提取的环节,简化了病毒检测的步骤,提高了检测的灵敏度。

双重DPO-RT-PCR检测南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒

南方菜豆花叶病毒及烟草环斑病毒是中国进境植物检疫性有害生物,属于大豆种传病害,为提高在进口大豆中两种病毒的检出率,本研究针对SBMV及TRSV基因组中的保守序列,分别设计特异性DPO引物,建立了一种快速检测这两种植物病毒的双重DPO-RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度及退火温度敏感性等性能进行评价。结果表明:该方法能准确地从10种植物病毒中鉴定出SBMV及TRSV,表现出良好的特异性,且检测灵敏度可达0.02 ng·μL^(-1),退火温度为在45~65℃时该方法检测结果无明显差异,表现出对退火温度不敏感的特性。研究结果为进出境植物病毒的高通量检测提供了新的思路。

抗感菜豆品种对菜豆普通花叶病毒侵染后的转录组分析

菜豆普通花叶病毒(BCMV)在世界范围内分布广泛并可造成菜豆严重减产。菜豆是BCMV的主要寄主,不同遗传背景的菜豆对BCMV侵染的响应存在显著差异,目前菜豆抗性基因功能及BCMV的致病机制鲜有报道。为了为菜豆抗性基因功能的研究以及分子抗病育种提供相关依据,利用转录组测序(RNA sequencing)技术对BCMV(C54株系)侵染感性及不同抗性的菜豆品种材料进行转录组测序,对所得数据筛选差异表达基因并进行Gene Ontology(GO)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集以及进行Weighted correla?tion network analysis(WGCNA)分析。结果发现,不同的菜豆品种中病毒的积累量、差异表达基因的定位及一些关键通路对病毒侵染的响应存在共性和差异(如昼夜节律、光合作用、植物-病原体的相互作用和一些代谢途径相关通路等)。在接种叶上,Dubbele witte品种(DW,对BCMV侵染易感)与Redland’s greenleaf C品种(RGLC,对BCMV侵染具有抗性)差异表达的基因类型上更为相似,定位于光合体系,在光合作用、光合作用-天线蛋白以及光合生物中的碳固定等通路富集,而Sanilac(对BCMV侵染具有抗性)的差异基因没有在光合作用等通路富集。在系统叶上,2个抗性品种中的差异表达基因类型也有差异。植物被病毒侵染后会干扰植物激素的合成与信号转导通路。通过选取8个关键的植物激素合成或信号转导相关基因进行验证,转录组和qPCR数据结果表明,不同的植物激素合成或信号转导相关基因在BCMV侵染菜豆后的表达情况存在差异:BCMV侵染促进了参与水杨酸、茉莉酸和赤霉素合成通路的关键基因的正向调控;乙烯、油菜素内酯以及脱落酸相关的基因在抗感品种中的表达变化趋势不相同。研究结果明确了BCMV侵染不同遗传背景的菜豆品种后的转录组差异反应。

逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒

根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。

实时荧光RT-PCR-步法检测南方菜豆花叶病毒

南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)是我国二类检疫性有害生物,以南方菜豆花叶病毒日本分离物(SBMV-J)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒外壳蛋白基因及其上游基因的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列分析结果表明:SBMV-J cp基因由801个核苷酸组成,编码266个氨基酸,SBMV-J与其它分离物及株系cp基因的核苷酸序列同源性为83%～97%,氨基酸序列同源性为86%～97%。由于SBMV各分离物及株系cp基因的同源性较低,难于设计出较长的普通PCR引物。通过较短引物设计和TaqMan-MGB探针技术,建立了SBMV的实时荧光RT-PCR一步检测方法。该方法的检测低限是0．16 pg,最佳检测总RNA的量是0．16 ng。

南方菜豆花叶病毒RT-RPA检测方法的建立

本研究针对南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)保守序列设计了特异性PRA引物,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),采用SBMV,BPMV,SMV,Ar MV和TRSV共5种病毒评价该方法的特异性,并对其灵敏度进行评价。结果显示,建立的RT-RPA方法特异性强;灵敏度达到0.1 ng。本研究建立的RT-RPA方法检测SBMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。

基于单克隆抗体的南方菜豆花叶病毒血清学检测技术

为建立南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,SBMV)的快速、简便、高通量检测技术,加强该病毒的口岸检验检疫,以提纯的SBMV粒子为免疫原免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤技术获得3株杂交瘤细胞株19C3、19H9和20G4,其分泌的SBMV腹水单抗效价均达到10-7,且3个单抗与感染SBMV大豆叶片组织粗提液有强烈的特异性免疫反应,而不与感染南方豇豆花叶病毒(southern cowpea mosaic virus,SCPMV)的豇豆、健康的大豆、毛豆、豌豆、蚕豆和菜豆叶片组织粗提液发生免疫反应。以制备的单抗为核心,建立了检测植物中SBMV的ACP-ELISA和dotELISA两种血清学方法。3个单抗中19H9单抗的检测灵敏度最高,以其建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测大豆病叶粗提液的灵敏度分别达到1∶163840和1∶10240稀释浓度。利用建立的dot-ELISA方法可从上海口岸截获的大豆种子中检测出SBMV,且该检测结果得到RT-PCR方法验证。表明制备的SBMV单抗及建立的SBMV血清学检测技术可有效用于我国SBMV的口岸检验检疫。

烟粉虱对菜豆金黄花叶病毒属病毒的传播:病毒对媒介昆虫的适应

双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黄花叶病毒属病毒是一类重要的植物病毒,主要危害番茄、烟草、棉花等多种经济作物,自然条件下主要由介体昆虫烟粉虱Bemisia tabaci传播。菜豆金黄花叶病毒属病毒在田间的暴发受多种因素的影响,其中一个最重要的因素就是其介体昆虫烟粉虱。因此,明确烟粉虱在田间传播和扩散特定病毒中的作用及影响因素,对于解析病毒病流行的生物学基础具有重要意义。本文综述了烟粉虱对菜豆金黄花叶病毒属病毒的传播及影响因素,并讨论了病毒对媒介昆虫的适应及其机制。菜豆金黄花叶病毒属病毒和烟粉虱都为全球分布的有害生物,通过生物信息学的分析发现,两者都呈现地域相关的遗传多样性。而在生物学的研究中发现,烟粉虱隐存种往往对与其起源于同一地区的病毒具有较高的传播效率。这些发现为进一步解析烟粉虱对菜豆金黄花叶病毒属病毒的传播提供了重要的参考。

菜豆普通花叶病毒RT-PCR检测及3′末端序列分析

根据哈尔滨地区豇豆感病植株的症状，初步鉴定感染豇豆的病毒为菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic， virus,SCMV）。利用马铃薯Y病毒属通用引物扩增出病毒基因组3’末端序列，经BLAST检索表明该病毒为BCMV，将该序列与GenBank上的21个BCMV分离物的3＇末端序列进行比较，显示其核苷酸序列与其他分离物的序列同源性为91.7％-97.3％。系统进化分析显示不同分离物可聚为5个类群，并显示出一定的寄主相关性。哈尔滨分离物BCMV-X与2个浙江分离物、1个澳大利亚分离物聚为一支，且该4株分离物的寄主均为豇豆。RNA二级结构分析显示BCMV基因组3’末端非编码区形成4个茎环结构，不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。

进境菜豆种子中南方菜豆花叶病毒的检疫鉴定

南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)是我国禁止进境的检疫性有害生物。应用RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法,从西班牙进境的菜豆种子中检疫鉴定出该病毒,这是我国首次在西班牙进境菜豆种子中截获该病毒。

逆转录交叉引物等温扩增检测南方菜豆花叶病毒方法的建立

南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus,SBMV)是我国进境植物检疫性病毒,可随豆类种子远距离传播。本研究针对SBMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计特异引物组,建立了一种反转录(reverse transcription,RT)交叉引物扩增(cross-priming amplification,CPA)快速检测方法,并分别结合实时荧光和侧向层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测扩增产物构建了实时荧光RT-CPA和RT-CPA-LFD体系。结果显示,所建立的针对SBMV的RT-CPA检测方法特异性强,以其他4种可随豆类种传的植物检疫性病毒为对照,均无交叉反应。其中,实时荧光RT-CPA和RT-CPA-LFD检测SBMV灵敏度分别达5×10^(-4)ng/μL和5 ng/μL。所建立的RT-CPA检测SBMV方法具有快速、准确、可视化等优点,在口岸检测中具有良好的应用前景。

一种新发现的侵染绿豆的菜豆普通花叶病毒分子鉴定

为确定从江苏省农科院蔬菜所温室大棚所采集到的表现花叶、皱缩、明脉症状的绿豆植株是由何种病毒引起的,采取了透射电子显微镜观察、RT-PCR、序列测序以及酶联免疫吸附法(ELISA)等方法进行鉴定。结果表明,在透射电镜下可观察到风轮状、束状病毒内含体,与Potyvirus属病毒粒子形态一致;对所提取的病样总RNA使用Potyvirus通用引物进行RT-PCR扩增,得到由1 082个核苷酸组成的序列,包含编码228个氨基酸的完整cp基因,产物通过NCBI比对,发现和已报道的菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus,BCMV)HB分离物同源性高达95%,初步判定该病原为菜豆普通花叶病毒(BCMV),命名为BCMV-JAAS分离物;通过扩增得到的cp基因,构建系统发育树,表明BCMV-JAAS与BCMV的其他中国分离物亲缘关系较近;通过ELISA检测,进一步确定是由菜豆普通花叶病毒(BCMV)感染引起的绿豆病毒病,这是我国第一次在绿豆上发现菜豆普通花叶病毒。