不同抑制剂和激活剂对菠萝茎蛋白酶酶学特性的影响

菠萝蛋白酶作为一种典型的巯基类蛋白酶,具有稳定性差、易失活的特性。本文通过研究多种抑制剂和激活剂对菠萝茎蛋白酶活力、动力学参数及光谱特性等的影响,总结其构效变化规律,试图解释菠萝蛋白酶失活及激活机理。结果表明:抑制剂与激活剂作用下菠萝茎蛋白酶的CD图谱均表现为α-螺旋度降低,β-折叠、β-转角以及无规卷曲含量不同程度提高,但抑制剂作用下螺旋降低,折叠与卷曲的升高程度更明显。此外,抑制剂与激活剂作用下菠萝茎蛋白酶的紫外差吸收光谱也显示差异,激活剂作用下主要表现为230nm以下的二级结构变化,而抑制剂除上述变化外,还显示生色基团Trp、Tyr、Phe的暴露吸收,表明抑制剂作用下酶分子构象变化更剧烈。本文可为菠萝茎蛋白酶的改性研究提供理论基础。

多糖和添加剂对菠萝茎蛋白酶活力的影响

以相对酶活力及热失活动力学为指标,研究不同类型的添加剂对菠萝茎蛋白酶活力的影响,并探讨作用机理,以提供菠萝茎蛋白酶存放和应用过程中的有效保护方法。结果表明:葡萄糖、海藻糖和可溶性淀粉对菠萝茎蛋白酶热稳定作用由高到低分别为:海藻糖>葡萄糖>可溶性淀粉;金属离子螯合剂(EDTA-2Na、多聚磷酸钠)、防腐剂(苯甲酸钠)和还原剂(焦亚硫酸钠、β-巯基乙醇)对菠萝茎蛋白酶活力保护机理不同,但适量使用都能使其酶活力得到提高,其中还原剂的激活效果最好;焦亚硫酸钠在质量分数为0.05%时,能显著提高菠萝茎蛋白酶活力,相对酶活力达3.68,且在存放3d后酶活力才降至原酶液水平。

菠萝茎蛋白酶的纯化及酶活力受超声处理影响的机理

对菠萝茎蛋白酶进行纯化和鉴定,并研究酶活力受超声处理影响的机理。采用羧甲基纤维素柱层析纯化、PAGE鉴定纯度,测定纯化的酶经超声波处理后的酶活性、动力学参数以及紫外和荧光光谱。柱层析分离出3个蛋白峰区域,其中第二蛋白峰经电泳鉴定纯度较高。酶经超声处理后Km变小,Vm也减小;紫外吸收光谱不变,而差示光谱出现了明显的正峰和负峰,荧光发射光谱基本不变。羧甲基纤维素柱层析对菠萝茎蛋白酶纯化效果较好,超声处理可能通过改变菠萝茎蛋白酶的构象从而改变酶活力。

海藻酸钠-壳聚糖共固定化菠萝茎蛋白酶的研究

以海藻酸钠、壳聚糖为材料共固定化菠萝茎蛋白酶,并对固定化条件以及固定化酶的酶学特性进行了研究。通过单因素及正交实验确定固定化酶的最佳条件为:酶用量0.4mg/g、海藻酸钠浓度3.0%、壳聚糖浓度1.0%、CaCl2浓度5.5%、固化时间90min。固定化后的酶重复使用4次后,相对酶活力仍保留80%以上,固化效果较好。同时,固定化酶最适反应温度和热稳定性提高,反应pH向碱性偏移,酶学特性得到了改善。

动态高压微射流对茎菠萝蛋白酶性质和构象的影响

以茎菠萝蛋白酶为原料,研究动态高压微射流(DHPM)对其活性、稳定性和构象的影响。结果显示:DHPM对茎菠萝蛋白酶具有钝化作用,但活力并不随着压力的升高而降低。压力为60、80、100、120MPa时,茎菠萝蛋白酶的相对酶活力分别是94%、93%、98%及92%。DHPM不同压力对茎菠萝蛋白酶的最适反应温度的影响不同,但对最适pH值几乎没有影响。然而经DHPM60、120MPa处理后,茎菠萝蛋白酶在pH8.0的稳定性显著增强。在pH8.0保温40min后,60、120MPa处理的茎菠萝蛋白酶相对酶活力分别为85%和82%,分别比未经处理的高14%和11%。可见,DHPM60、120MPa处理极大地提高了茎菠萝蛋白酶在pH8.0时的稳定性。此外,紫外光谱和荧光光谱的结果表明:DHPM导致茎菠萝蛋白酶部分去折叠,分子中赖氨酸和色氨酸残基所处的微环境发生了变化;红外光谱结果显示:DHPM处理后茎菠萝蛋白酶二级或三级结构发生了变化。

菠萝蛋白酶工业化提取工艺的改良及酶学性质研究

以菠萝茎为原料,利用微滤除杂、超滤浓缩分离得菠萝蛋白酶浓缩液,再通过硫酸铵法进行沉淀,最后进行真空冷冻干燥制取菠萝蛋白粗酶;而为了验证其酶学性质,采用SephadexG-100柱层析和DEAE-52离子交换层析制得纯度较高的菠萝蛋白酶。结果表明:菠萝茎打浆后原液通过微滤除杂、超滤浓缩,再采用90%硫酸铵沉淀等工序后,纯化倍数达1.44,是目前工厂制酶的1.19倍,酶活收率与原液相比只降低9%,具有工业化生产的优越性;经SephadexG-100柱层析和DEAE-52柱层析后,达到电泳纯,可满足医药用酶所需,存在很好的市场应用价值;且该菠萝蛋白酶的酶学性质与有关报道基本一致,最适反应pH在5～6之间,最适温度60℃,重金属离子如Cu2+、Fe2+、Pb2+等对菠萝茎蛋白酶活抑制较大,而Na+、K+、Ca2+则表现出不同程度的激活作用。