菲牛蛭素对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化体内脂质代谢和血管斑块的影响

目的探讨菲牛蛭素对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化体内脂质代谢和血管斑块的影响。方法将24只高脂饮食饲养的雄性ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型组,菲牛蛭素高、低剂量给药组和辛伐他汀阳性给药组,每组6只。另取6只C57BL/6J小鼠作为空白对照组,正常饲料喂养。之后连续给药干预8周,末次给药后,检测血脂水平,HE染色及Masson染色观察主动脉血管病理学改变;免疫组化染色分别观察菲牛蛭素对小鼠主动脉粥样斑块中增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞凋亡蛋白-3(caspase-3)蛋白的影响。结果与空白对照组比较,模型组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,菲牛蛭素高、低剂量组小鼠血清TC、TG和LDL-C水平显著降低,HDL-C水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。Masson染色显示,与模型组比较,菲牛蛭素高、低剂量组小鼠血管斑块中的胶原含量显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。免疫组化染色结果显示,与空白对照组比较,模型组小鼠主动脉粥样斑块PCNA蛋白表达显著下调,caspase-3蛋白表达显著上调,差异均有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,菲牛蛭素组小鼠主动脉粥样斑块PCNA蛋白表达显著上调,菲牛蛭素高剂量组的caspase-3蛋白表达显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论菲牛蛭素可以通过降低ApoE^(-/-)小鼠血清血脂水平,延缓平滑肌细胞凋亡,稳定血管斑块等方面来抑制动脉粥样硬化的发展。

菲牛蛭素体内外抗凝实验研究

目的:研究广西菲牛蛭中提取的两种菲牛蛭素———菲牛蛭素A(BufrudinA,BA)和菲牛蛭素B(BufrudinB,BB)在人体外及动物体内的抗凝作用。方法:观察菲牛蛭素在人体外及动物体内对部分活化凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)的影响。结果:在体内外实验中,BA、BB均能明显延长活化部分APTT、PT及TT,但两者的三个指标有明显差异性,其中BA对TT的作用最显著,BB则对PT的作用更强。结论:广西菲牛蛭中的抗凝物质BA、BB在体内外均有较强的抗凝活性。

菲牛蛭素对血管新生作用的研究

目的:通过菲牛蛭素刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管,研究其对血管新生的影响。方法:体外培养HUVEC,以血管内皮生长因子(VEGF)作阳性对照药,采用四甲基噻唑蓝(MTT)比色法测定菲牛蛭素对HUVEC细胞活力的影响,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测菲牛蛭素对HUVEC培养液中VEGF释放含量的影响;制备CAM模型,生理盐水作对照,观察不同浓度菲牛蛭素对血管生成的影响。结果:菲牛蛭素终浓度0.25U/mL时细胞活力最强,与空白对照组比较增殖率为28.4%,且在此浓度培养液中VEGF含量最高,比空白对照组高出80.7%;与生理盐水对照组比较,CAM血管总数明显增加,大、中血管数增加显著(P<0.01),小血管数变化不明显(P>0.05),其中以22U/mL剂量组增生作用最明显。结论:菲牛蛭素对血管新生具有促进作用,这可能为缺血性疾病治疗提供依据。

菲牛蛭素对凝血酶诱导血管内皮细胞活力和vWF、PAI-1、t-PA分泌量的影响

目的:通过研究菲牛蛭素对凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞活力和血管假性血友病因子(vWF)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、组织纤溶酶原激活物(t-PA)分泌量的影响,进一步明确菲牛蛭素抑制血栓形成作用机制。方法 :通过体外培养HUVEC,建立凝血酶细胞损伤模型,四甲基噻唑蓝(MTT)法测定不同浓度凝血酶对细胞活力的影响,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测培养液中LDH含量,根据以上结果选取凝血酶最佳诱导浓度进行试验;肝素为阳性药,菲牛蛭素分终浓度为1U/mL、3U/mL、4U/mL 3个剂量组,MTT法测定菲牛蛭素对模型细胞活力的影响,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测培养液中vWF、PAI-1、t-PA含量,LDH试剂盒检测培养液中LDH含量。结果:凝血酶15U/mL浓度组诱导作用明显;与凝血酶模型组比较:菲牛蛭素中剂量和大剂量组保护凝血酶对HUVEC的损伤的效果明显(P<0.01),菲牛蛭素小、中、大剂量组明显减少vWF、PAI-1分泌,增加t-PA含量(P<0.01)。结论:高浓度菲牛蛭素具有保护凝血酶对血管内皮细胞的损伤作用,对内皮细胞抗凝、纤溶和血小板活化具有调节作用,使内皮细胞的抗凝、纤溶功能趋于正常,抑制血小板活化。其作用可能与菲牛蛭素对抗凝血酶诱导内皮细胞的损伤,抑制vWF和PAI-1,增加t-PA的分泌释放,增加t-PA/PAI-1比值有关。

菲牛蛭素对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的干预作用

目的研究菲牛蛭素对载脂蛋白E基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠动脉粥样硬化及斑块的干预作用。方法按照体重将高脂饲料喂养的雄性ApoE^(-/-)小鼠随机分为3组:模型组、对照组(给予辛伐他汀3mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃)和实验组(给予菲牛蛭素400 U·kg^(-1)·d^(-1)腹腔注射);另设C57BL/6J小鼠为正常组(不予任何处理)。给药10周后,全自动生化仪检测各组小鼠血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平,以免疫组化法检测主动脉血管标记物CD34蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体(VEGFR-2)的表达。结果给药后,模型组、对照组和实验组血清TG分别为(1.57±0.12),(1.10±0.21),(0.95±0.20)mmol·L^(-1);这3组的TC分别为(19.93±2.24),(14.47±1.30),(11.90±2.38)mmol·L^(-1);这3组的LDL-C分别为(17.24±1.52),(13.94±1.46),(10.02±2.14)mmol·L^(-1);这3组的HDL-C分别为(4.05±1.81),(4.62±0.50),(3.38±0.24)mmol·L^(-1),与模型组相比,实验组差异均有统计学意义(均P<0.01)。模型组、对照组和实验组的斑块胶原相对含量分别为(21.48±2.44)%,(37.12±3.33)%,(51.60±2.47)%;这3组的CD34蛋白含量分别为(11.02±1.64)%,(6.82±0.66)%,(4.56±0.59)%;这3组的VEGF蛋白分别为(22.13±2.04)%,(16.20±0.65)%,(11.16±0.82)%;这3组的VEGFR-2蛋白表达分别为(17.90±0.73)%,(15.11±0.52)%,(10.56±0.60)%;与模型组相比,实验组差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论菲牛蛭素可改善ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化,稳定粥样斑块,其机制可能与减少VEGF和VEGFR-2表达、抑制斑块微血管新生有关。

Analysis of the chemical compositions of Hirudinaria manillensis

Aim To determine and analyze fatty acids, amino acids and trace elements of Hirudinaria manillensis. Methods Contents of fatty acids, amino acids and trace elements were determined by GC/MS, HPLC and ICP-AES. Results H. manillensis contained sixteen fatty acids, among which the percentage of unsaturated fatty acids is 34.05%. The eighteen amino acids were detected, which included eight essential amino acids in human body with a ratio of 33.53 %. There were eight trace elements （Ca, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, V and Zn） from H. manillensis, and the content of Ca, Zn and Fe were apparently higher than those of other elements. Conclusion These methods are simple and accurate. This study reports routine quantitative methods for the analysis of multiple components in H. manillensis by GC/MS, HPLC and ICP-AES.