萘降解菌N19-3的分离、鉴定和萘双加氧酶基因的检测

从石油污染土壤中分离到一株高效降解萘的N19-3菌株.经形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析等鉴定其为丛毛单胞菌属（Comamonassp.）.该菌株能在30℃,30 h内将1 000 mg/L的萘完全降解.降解萘的适宜温度为20-30℃,适宜pH为7.0-9.0.0.1 mmol/L的Ca^2＋和Fe^3＋对N19^-3菌株降解萘有较强的促进作用,0.1 mmol/L的Mn^2＋和Zn^2＋对N19-3菌株的生长和萘的降解也有一定的促进作用,而0.1 mmol/L的Cu2＋则完全抑制了N19-3菌株的生长和萘的降解.通过PCR方法在N19-3菌株中扩增出分别与C.testosteroniH菌株的萘双加氧酶铁硫蛋白大亚基基因（pahAc）与双加氧酶铁硫蛋白小亚基基因（pahAd）高度同源的核苷酸片断.

珠江口萘双加氧酶基因多样性及其与环境因子相关性分析

选取珠江口上游到下游的四个站点采用16S rRNA-DGGE方法分析了珠江口表层沉积物中微生物群落结构。结果表明:四个站点中微生物组成差别较大,并且珠江口上游的微生物多样性稍低于下游。基于萘双加氧酶基因(ndo基因)的DGGE分析则表明珠江口上游和下游区域中的ndo基因多样性(站点A1和A4)高于珠江口中游(站点A2和A3)。为了进一步探讨环境因子与ndo基因分布的相关关系,典型对应分析(canonical correspondence analysis,CCA)发现站点A1中ndo基因组成主要受NH4-N影响,该基因在站点A2的分布主要与SiO3-Si正相关,而站点A4的该基因组成则与盐度的相关性较高。研究结果能为珠江口的PAHs生物降解提供重要理论参考。

嗜盐菌群对菲的降解及萘双加氧酶基因的表达规律

从胜利油田富集了一个能够降解多环芳烃的嗜盐菌群,通过克隆文库技术解析了菌群萘双加氧酶(ndo)基因的多样性.结果表明,该嗜盐菌群有6种ndo基因型,其中3种主要基因型(占总克隆子92.7%)与经典nah-like基因的相似度为89%.采用real-time RT-PCR等技术分析了不同盐度下菲降解过程中ndo基因的表达量、降解速率、生长曲线以及菲的生物可利用度,探索了菌群对菲的降解及ndo基因的表达规律.结果表明,当盐度由10%升高到20%,菌群完全降解100mg/L菲的时间从6d延长到9d,菌群生长的迟滞期由1d延长为3d.溶解菲的浓度在菌群生长过程中呈增加的趋势.Ndo基因的表达量在降解过程中呈先降低后随溶解菲浓度升高而升高的趋势,表明高浓度菲在初始阶段可能抑制ndo基因的表达.单因素方差分析(n=3,P>0.05)表明溶解菲浓度在10%和20%盐度下没有显著差异,表明一定范围的盐度不会影响菌群降解过程中菲的溶解度.菌群ndo基因的相对表达量在10%盐度下较在20%盐度下高,说明盐度对嗜盐菌群功能基因的表达具有抑制作用.

新疆准东油田石油污染土壤萘双加氧酶基因的多态性

为了分析新疆准东油田石油污染土壤中萘双加氧酶功能基因的多态性,采用无机盐培养基,以萘为唯一的碳源物质,对准东油田石油污染土壤中的萘降解菌进行液体富集培养,用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,简称HPLC)对降解产物进行检测,同时采用萘双加氧酶基因通用引物对萘双加氧酶基因片段进行扩增、测序及分析。高效液相色谱检测结果显示,萘被降解成小分子产物,证明液体培养基均富集培养获得了萘降解菌群。从准东油田共分离得到了49条萘双加氧酶基因片段,共编码35条氨基酸序列,GenBank登录号为KY304781~KY304829。获得的萘双加氧酶基因系统发育树结果显示,研究获得的萘双加氧酶基因分为4个类群。通过高效液相色谱分析及萘双加氧酶基因的分子检测,证明准东油田石油污染土壤中含有萘降解菌株,这些萘降解菌株是可以通过液体富集培养获得的,并且可以通过固体平板获得降解萘的单菌株。

准东油田萘降解菌群培养及菌群双加氧酶基因多态性分析

采用无机盐培养基,以萘为惟一的碳源物质对准东油田石油污染土壤中的萘降解菌进行液体富集培养。经过5次培养后,利用固体平板对获得菌群萘降解能力进行检测,同时利用HPLC对降解产物进行检测。离心收集富集培养基中的菌体,提取基因组DNA,基于Illumina Miseq测序平台对16S r RNA序列进行测序及生物信息学分析,同时采用萘双加酶基因通用引物对萘双加氧酶基因片段进行扩增、测序及分析。结果表明,含有萘的固体平板有清晰透明斑的出现;高效液相检测结果显示,萘被降解成小分子产物,证明液体培养基可富集培养获得萘降解菌群。萘降解菌群16S r RNA测序比对结果显示,富集培养获得菌群分属于5门9纲15目24科31属,共33种细菌。另外共获得萘双加氧酶基因片段11条,GenBank注册号为KY304819-KY304829。系统发育树结果显示,所获萘双加氧酶基因分为4个类群。通过HPLC及双加氧酶基因的分子检测,验证已从准东油田石油污染土壤当中富集培养获得萘降解菌群。