萘质粒转移到大肠杆菌中合成靛蓝的研究

利用含有萘降解质粒的假单胞菌,通过接合和转化,把这种质粒转移到大肠杆菌中,获得接合子和转化子。这种接合子和转化子不仅在L-培养基中能合成靛蓝,而且能在以萘作唯一碳源和能源的培养基中生长繁殖。因此,本工作不仅为微生物合成染料开拓新的途径,而且对研究环境有毒污染物降解菌的遗传工程也具有一定的意义。

萘降解质粒pND6-1中萘趋化基因nahY的克隆和核苷酸序列分析

假单胞菌 (Pseudomonas)ND6菌株的萘降解基因位于 10 2kb的质粒 pND6 1上 .以pUC18质粒为载体 ,制备了含有 1.5～ 3 .0kbpND6 1DNA随机片段的基因文库 .通过DNA测序和DNA序列的同源性分析 ,从基因文库中筛选出含有萘趋化基因nahY的克隆 .nahY基因的大小为 16 17bp ,编码的萘趋化蛋白由 5 38个氨基酸组成 ,与假单胞菌G7菌株的nahY基因相比 ,核苷酸序列的同源性是 96 .7% ,编码的氨基酸序列的同源性是 95 % .图 4参

恶臭假单胞菌ND6菌株中与萘降解相关的新型水杨醛脱氢酶NahV

在大肠杆菌中表达了Pseudomonas putida ND6菌株中与萘降解有关的水杨醛脱氢酶同工酶NahV,并对其酶学性质进行了研究.结果表明,NahV与ND6菌株中经典的水杨醛脱氢酶NahF的氨基酸序列同源性较低,是一种新的水杨醛脱氢酶.对NahV和NahF的酶动力学研究结果表明,NahF具有更高的催化效率,而NahV对水杨醛和NAD+的亲和力更强.ND6菌株的NahV和NahF都有较宽的底物范围,可以催化水杨醛、5-氯水杨醛、甲醛、间硝基苯甲醛、邻硝基苯甲醛、邻甲氧基苯甲醛、戊二醛、辛醛和乙二醛的脱氢反应,但对不同底物的催化效率不同.Fe2+,Cu2+和Zn2+对NahV有激活作用,而NahF只能被Fe2+激活.NahF具有更好的热稳定性,在50℃保温30min仍有72.8%的酶活力,而NahV则丧失了88.8%的酶活力.DNA斑点杂交结果表明,类nahF基因在本研究检测的两种来源的萘降解细菌中都存在,而类nahV基因只存在于一种来源的萘降解细菌中.