植物萜类合酶研究进展

随着植物中许多有价值的萜类化合物被发现和应用于人类生活 ,萜类生物合成途径的研究倍受重视。萜类合酶催化单萜、倍半萜和二萜生物合成 ,即分别催化GPP、FPP和GGPP形成单萜、倍半萜和二萜。本文叙述了近年来在植物萜类合酶催化机理。

工程酵母助力真菌嵌合萜类合酶的快速系统挖掘

真菌特有的嵌合萜类合酶(简称为PTTS)由C端异戊烯基转移酶(PT)结构域和N端I型萜类合酶(TS)结构域组成,可直接催化异戊二烯单元产生结构多样的二萜和二倍半萜化合物。自2007年发现第一个PTTS以来,只有约20个PTTS的功能被验证,人们对PTTS的起源和功能进化的认识还十分有限。最近武汉大学刘天罡教授课题组与美国田纳西大学陈峰教授课题组合作,运用高效萜类前体供给的酿酒酵母底盘并结合高通量的自动化平台,对PTTS的起源和功能进化进行了深入系统的探索,扩充了嵌合萜类合酶家族成员的数量,并为萜类化合物的挖掘提供了一个高效的方法。

丹参萜类合酶基因家族的鉴定和表达模式分析

目的:利用生物信息学方法从基因组层面对丹参萜类合酶(SmTPS)基因家族成员进行全面鉴定和功能预测。方法:从国家基因组科学数据中心(NGDC)、美国国家生物技术信息中心(NCBI)、拟南芥信息资源中心(TAIR)和番茄功能基因组学数据库(TFGD)分别获取丹参、拟南芥和番茄基因组与转录组数据。借助Perl语言、TBtools等工具对SmTPS进行全基因组鉴定与生物信息学分析。结果:共鉴定出52个TPS成员分布在丹参的8条染色体上;编码氨基酸数目在207~822 aa;等电点在4.76~9.16,分子质量为24.11~94.81 kDa,所有成员均为亲水蛋白。基因结构分析表明不同亚族成员之间内含子数差异明显,72.6%TPS-a、TPS-b、TPS-g亚族成员为6,88.9%TPS-c、TPS-e/f亚族成员>10;蛋白motif相对保守。顺式作用元件分析表明,SmTPSs启动子区均含有大量光响应元件,大多数SmTPSs启动子区含有激素响应元件。基因表达模式分析显示SmTPS家族成员存在组织表达特异性,24个基因响应外源茉莉酸甲酯。结论:基于已发表丹参基因组,鉴定得到52个SmTPS家族成员,结合系统进化与表达模式对其功能进行了预测。该文为丹参中萜类化合物生物合成及调控机制全面解析提供了参考信息。

樟树化学型形成关键萜类合酶的系统鉴定

樟树Cinnamomum camphora为我国重要的经济树种。根据叶片挥发油中主要成分的种类和含量,樟树通常被分为龙脑型、樟脑型、芳樟醇型、桉叶油型和橙花叔醇型5种化学型,萜类合酶(terpene synthase,TPS)是形成这些化合物的关键酶。虽然多个关键酶基因已得到鉴定,但最具经济价值的(+)-龙脑的生物合成途径未见报道。该研究通过对4种化学型叶片的转录组分析,克隆了9个萜类合酶基因CcTPS1~CcTPS9。经过大肠杆菌诱导表达重组蛋白后分别以香叶基焦磷酸(GPP)和法尼基焦磷酸(FPP)为底物进行酶促反应,结果CcTPS1和CcTPS9均可催化GPP生成冰片基焦磷酸,并在磷酸水解酶的作用下得到(+)-龙脑,产物占比分别为0.4%、89.3%。CcTPS3和CcTPS6均可催化GPP生成单一产物芳樟醇,CcTPS6还可与FPP反应生成橙花叔醇。CcTPS8与GPP反应生成1,8-桉叶油(30.71%)。9个萜类合酶共计产生9个单萜和6个倍半萜类化合物。该研究首次确定樟树中负责(+)-龙脑生物合成的关键酶基因,为进一步阐明化学型形成的分子机制及利用生物工程技术培育高产龙脑新品种奠定了基础。

阳春砂基于转录组的萜类合酶基因挖掘及一个单萜合酶基因的克隆

【目的】深入挖掘阳春砂转录组中挥发性萜类合酶相关基因,为全面认识阳春砂挥发性萜类代谢途径和分子调控模式奠定基础。【方法】整理前期工作获得的阳春砂2个转录组的数据,筛选已注释的及利用本地blast方法再注释的萜类合成途径的unigene;并通过对部分候选unigene的表达量与挥发性萜类化合物含量的相关性分析及生物信息学分析,进一步筛选出相关基因;采用PCR及重组载体构建的方法克隆其中一个单萜合酶基因,并对其编码蛋白序列进行分析。【结果】筛选得到10个挥发性萜类合成上游途径相关unigene及11个下游萜类合酶基因;相关性分析证明候选基因与阳春砂主要挥发性萜类有较强相关性;并成功克隆得到Av TPS1基因,其序列包含1 803 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸;其编码蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W和NSE/DTE等保守基序,N端含有一段叶绿体转运肽;系统进化分析表明Av TPS1属于TPS-b亚家族。【结论】结合转录组、表达谱数据的深入挖掘和与挥发性萜类化合物数据的关联,有效筛选出了阳春砂多个值得后续研究的萜类合酶基因;其中对Av TPS1的克隆及生物信息学分析为后续功能鉴定提供了基础。

温郁金萜类合酶基因CwTPS4的克隆和表达特征

温郁金是著名的"浙八味"之一,药用价值高、应用广泛,萜类化合物是其主要的药用成分。萜类合酶是植物萜类化合物生物合成途径中的关键酶。依据温郁金根茎的转录组数据,采用反转录PCR获得了1个萜类合酶基因CwTPS4(GenBank登录号:MW774935),其开放阅读框长1 515 bp,编码504个氨基酸,含有萜类合酶特有的结构域和保守序列RXR、DDXXD等;生物信息学分析表明CwTPS4编码的蛋白定位在细胞质中、无跨膜区域,为水溶性的稳定蛋白,属于萜类合酶的TPS-a亚家族成员。实时荧光定量分析表明,CwTPS4基因主要在生长旺盛的叶片中表达,其次在根茎膨大初期的根茎中表达量较高,而在成熟或衰老的组织中表达量较低。本研究从温郁金中克隆得到1个新的萜类合酶基因CwTPS4,经生物信息学分析表明CwTPS4可能参与了温郁金中倍半萜类化合物的合成,为下一步研究其在温郁金萜类物质合成中的功能奠定了一定的基础。

植物萜类合酶研究新进展

近年来,植物中的萜类化合物除被用作药物、香料等产品的原料外,还广泛参与植物抗病、抗逆等生物防治过程。萜类合酶作为催化萜类化合物合成的核心酶也成为新的研究热点。本文就植物中萜类合酶的结构特点、系统进化、功能分类、催化途径、生理功能等方面进行综述。通过系统进化分析,对萜类合酶基因家族的成员进行分类,发现萜类合酶可能起源于包含双官能团的二萜合酶,其中小立碗藓(Physcomitrella patens)中的PpCPS/KS是典型的包含双官能团的二萜合酶。通过分析多个植物基因组中的萜类合酶基因家族的特点,分别总结了单萜合酶、倍半萜合酶、二萜合酶的酶结构和催化特性;并发现有些萜类合酶在萜类合成途径中形成基因簇参与萜类化合物的合成。本文还总结了萜类合酶基因的研究方法。

甜菜夜蛾和茉莉酸甲酯处理对棉花茉莉酸合成途径关键基因及萜类合酶基因表达的影响

本文以陆地棉(Gossypium hirsutum)‘石远321’为实验材料,采用实时荧光定量PCR技术,研究了经甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)取食诱导和茉莉酸甲酯(MeJA)处理的茉莉酸(JA)合成途径中关键基因及萜类合酶基因的时间表达模式。甜菜夜蛾取食陆地棉后,JA合成途径脂氧合酶基因(GhLOX1和GhLOX2)、丙二烯氧化物合酶基因(GhAOS)、丙二烯氧化物环化酶基因(GhAOC)随处理时间变化均有不同程度的上调表达,其中GhLOX2表达量上调最明显,处理后12和72h表达量分别上升64.4和118.7倍;5个萜类合酶基因GhTPS1、GhTPS2、GhTPS3、GhTPS4、GhTPS5随处理时间变化表达模式明显不同,GhTPS4和GhTPS5表达量明显升高。外源MeJA处理后,GhLOX2表达量急剧上升,变化最大;5个萜类合酶基因均受MeJA诱导表达,但表达量在处理后不同时间有明显差异,GhTPS4处理后各时间点的表达量均高于对照。这些结果表明JA合成途径的GhLOX2和萜类合酶基因GhTPS4是响应甜菜夜蛾取食诱导和MeJA处理最为重要的基因。

阳春砂3个萜类合酶基因启动子的克隆及其参与萜类调控的分析

目的获得药用植物阳春砂Amomum villosum萜类合酶基因Av BPPS(bornyl diphosphate synthase)、AvLIS(linalool synthase)和AvHUS(humulene synthase)的启动子,探究其顺式作用调控元件参与萜类合成的调控。方法从阳春砂叶片基因组DNA(genomic DNA,gDNA)中分别克隆获得AvBPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA序列,据此设计特异引物,再通过FPNI-PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)方法分别克隆其启动子并进行生物信息学分析,结合转录组及对应萜类含量数据,分析其较为关键的顺式作用调控元件与萜类调控的关系。结果获得Av BPPS、AvLIS和AvHUS的gDNA长度分别为2374、2295、2362 bp,均包含相应基因的完整编码区和7个外显子。进一步克隆获得470、934、762 bp的启动子。AvBPPS启动子含有参与胚乳表达的顺式作用调控元件GCN4-motif,结合基因表达量的分析,该顺式作用调控元件调控了AvBPPS在阳春砂药用部位种子中的特异表达,进而影响了主要药效萜类成分龙脑、乙酸龙脑酯等在种子中的积累。AvLIS和AvHUS启动子均含有参与茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)反应的顺式作用调控元件,转录组和萜类含量的分析显示AvLIS响应高浓度MeJA的诱导,而AvHUS没有表现出对MeJA的响应。结论首次从药用植物阳春砂的启动子中发现了参与胚乳表达和MeJA反应的调控元件,为深入探究萜类合成关键酶的种子表达特异性和对MeJA响应的机制提供了基础,为萜类代谢的调控提供了操作元件。

玉米根部萜类合酶基因对干旱与激素处理的表达差异分析

选用两个具有抗性差异的玉米自交系B73与Mo17,分别对其根部进行干旱、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及茉莉酸甲酯与乙烯利联合(MeJA/EP)处理,定量检测4个与防御相关的萜类合酶基因An2、ZmTPS6、ZmTPS8以及ZmTPS26的表达情况。结果表明,4个基因在B73与Mo17应对干旱和ABA处理时基因表达差异明显。在Mo17中,干旱胁迫以及ABA处理显著诱导4个基因的表达;在B73中,干旱处理导致An2、ZmTPS6和ZmTPS8基因表达下调,在ABA处理下时,只有ZmTPS6被显著上调;MeJA与MeJA/EP处理在B73与Mo17中都能上调4个基因的表达,但在Mo17中的诱导程度更剧烈。B73与Mo17的根部在响应胁迫时存在显著的萜类代谢差异,可能为其抗性差异原因之一。

植物萜类化合物生物合成与调控及其代谢工程研究进展

萜类化合物大多属于次生代谢产物,在自然界中分布广泛、数量众多,并且结构和功能多样,在药品、农业和工业生产中应用广泛。近年来人们对植物萜类化合物进行了大量深入的研究,主要包括萜类化合物的分离鉴定和药理研究,生物合成相关基因的克隆和相关酶的功能鉴定,以及代谢工程等方面。文章从植物萜类化合物的生物合成和调控以及代谢工程进行综述,分析了植物中萜类化合物的研究进展。

基于全基因组的栀子花香成分合成TPS基因系统分析

栀子(Gardenia jasminoides J.Ellis)花色洁白且香气怡人,不仅具有极高的观赏价值,还是重要天然香料来源。萜类是栀子花独特香气的主要组成成分,但合成该类挥发性产物的关键萜类合酶(TPS)尚未鉴定。本研究基于栀子高质量基因组,通过转录组数据、系统发育树和保守结构域分析等,全面挖掘栀子萜类花香成分合成相关的TPS基因。结果显示,栀子基因组共注释到44个GjTPS基因,不均匀分布于11条染色体,其中9个GjTPS参与串联复制事件。所有GjTPS被划分为5个亚家族,其中27个属于被子植物特有的TPS-a、TPS-b和TPS-g分支。结合栀子5个器官的转录组数据及实时荧光定量PCR分析,筛选出5个候选GjTPS基因,其在盛开期的花器官中特异高表达,且含有DDXXD和NSE/DTE活性基序。其中,GjTPS1、GjTPS2、GjTPS3和GjTPS27为TPS-b分支酶,推测为芳樟醇或罗勒烯等栀子主要花香成分合成酶,而TPS-a分支的GjTPS18可能是金合欢烯合酶。

结球甘蓝香叶基芳樟醇合酶基因的克隆及功能分析

萜类化合物在植物防御病虫害等胁迫中具有重要的生物学和生态学功能,香叶基芳樟醇合酶(geranyllinalool synthase,GES)是萜类合成途径中的关键酶。为解析结球甘蓝中GES的功能,本研究采用聚合酶链反应方法克隆了该基因,检测其在生物胁迫诱导下的表达特性,并对其蛋白质的原核表达特性及生化功能进行了研究和测定。结果表明:BoGES蛋白质的氨基酸序列在十字花科植物中高度保守;小菜蛾、丁香假单胞菌(Pst DC3000)、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导均能上调BoGES基因的表达,说明该基因参与生物胁迫诱导的反应;该蛋白质能够以香叶基香叶基焦磷酸为底物催化合成香叶基芳樟醇。此外,用“Y”型嗅觉仪测定玉米螟赤眼蜂对不同浓度香叶基芳樟醇的行为反应,发现香叶基芳樟醇能够吸引赤眼蜂。综上所述,本研究对结球甘蓝中的BoGES基因功能进行了系统研究,为进一步研究十字花科植物中萜类合酶及萜类化合物的生物学和生态学功能提供了科学依据。

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列,利用原核系统表达融合蛋白,为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础,设计特异性引物,PCR扩增CnTPS1的全长编码序列,利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体,体外诱导目的蛋白表达。结果CnTPS1编码序列全长1749bp,编码582个氨基酸;基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高;原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1,运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测,分析了该基因的组织表达模式,并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白,这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。

植物萜类生物合成中的后修饰酶

萜类化合物由于其结构类型丰富多样而被称为"terpenome"。除了参与植物生长发育、环境应答等生理过程,萜类化合物还应用于医药、有机化工等领域。萜类的生物合成大致可分为前体形成、骨架构建以及后修饰三部分,基本骨架通常由萜类合酶催化形成,进一步在后修饰酶的作用下产生数以万计的萜类化合物。结合我们对香茶菜二萜生物合成的初步研究结果,本文主要针对近年来植物萜类生物合成中的一些有代表性的后修饰酶包括P450单氧酶、双键还原酶、酰基转移酶和糖基转移酶,进行研究现状分析与展望。

大果木姜子LlTPS11基因克隆及生物信息学分析

大果木姜子为贵州十大苗药之一,因其挥发油具有独特的香味及药用价值,被广泛应用于食品、药品行业。萜类化合物是植物中重要的次级代谢产物,可影响果实风味和花香,并间接起预防虫害的作用。大果木姜子挥发油主要为萜类物质,萜类合酶(TPS)是萜类物质的合成途径中关键基因。本文以大果木姜子为研究对象,克隆出LlTPS11的全长编码序列。利用生物信息学分析软件对LlTPS11氨基酸序列进行分析,结果表明,LlTPS11编码区序列长1692 bp,编码563个氨基酸,分子质量为65.41 kDa,LlTPS11属不稳定亲水性的酸性蛋白。不具有跨膜结构域及信号肽。该蛋白二级结构中主要含有α-螺旋67.32%,结果与三级结构预测结果一致。LlTPS11具有植物萜烯环化酶催化活性位点,与沉水樟萜类合酶CmTPS具有较高同源性。综上所述,本文对大果木姜子萜类合酶基因进行初步研究,为进一步研究萜类物质合成代谢途径及樟科植物中萜类物质提供理论依据。

华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因的克隆及表达

【目的】研究华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因及其表达特性,为揭示其在华山松抵御华山松大小蠹和蓝变真菌秦岭细粘束孢的入侵机制提供理论依据。【方法】运用PCR和RACE技术克隆华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因cDNA序列;利用生物信息学方法分析基因的核苷酸序列和编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统发育树;通过实时荧光定量PCR技术分析华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在MeJA处理和秦岭细粘束孢侵染后的表达差异。【结果】华山松alpha-pinene synthase基因编码区全长为1887 bp,编码的蛋白由628个氨基酸组成,分子质量为71.59 kDa,理论等电点为5.86。华山松(-)-limonene synthase基因编码区全长为1905 bp,编码的蛋白由634个氨基酸组成,分子质量为73.01 kDa,理论等电点为5.97。经实时荧光定量PCR分析,MeJA处理后alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因在不同时间均被诱导表达,其中alpha-pinene synthase基因表达量在第2天达到最高峰,(-)-limonene synthase基因表达量在第4天达到最高峰;秦岭细粘束孢侵染后alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因均被诱导表达,但表达量在处理后不同时间有明显差异。结果表明华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因是响应MeJA处理(模拟华山松大小蠹入侵危害)和秦岭细粘束孢侵染重要的基因。【结论】华山松alpha-pinene synthase基因和(-)-limonene synthase基因能够响应MeJA处理和秦岭细粘束孢侵染,这对进一步揭示寄主华山松抵御华山松大小蠹和蓝变真菌入侵机制提供了理论依据。

植物花香物质合成与调控研究进展

花香是观赏植物重要的观赏性状之一,深受消费者的欢迎。花香物质主要是萜类和苯环型化合物。萜类化合物中的单萜和倍半萜是观赏植物主要的花香成分,它们分别是通过MVA和MEP途径,在萜类合酶的催化作用下合成。萜类合酶的种类和功能决定了萜类物质的多样性,随着大量有价值的萜类被发现,萜类合酶已成为萜类化合物生物合成及调控的研究焦点。苯环型/苯丙烷类是花香成分的第二大类物质。目前从观赏植物中已经分离出大量的花香物质合成基因,并对它们的结构、功能及表达模式进行了分析研究;同时发现一些转录因子调控萜类和苯丙烷代谢途径基因表达,这些为人们了解花香释放规律,使用基因工程定向改变花香物质成分和含量提供理论基础。本综述对观赏植物的花香成分、测定和分析方法,编码花香物质合成的关键酶基因及迄今发现的调控花香物质合成的转录因子等方面进行了综述。

铁棒锤转录组分析及乌头碱生物合成相关基因的挖掘

铁棒锤Aconitum pendulum为常用藏药,乌头碱类化合物是其主要活性成分,具有较高的药用价值。为研究铁棒锤乌头碱类生物合成途径,首次采用Illumina HiSeqTM2000高通量测序技术对铁棒锤转录组进行分析,分别构建其根、叶和花转录组数据库。Trinity de novo组装得到47264条unigenes,平均长度1140 bp,N50为1678 bp,30231条unigenes(63.96%)在7大公共数据库得到注释。KEGG分析发现542条unigenes参与17个次生代谢通路,56条unigenes编码乌头碱生物合成20种关键酶基因。其中44条unigenes编码乌头碱类二萜母核生物合成的20种酶类,12个BAHD酰基转移酶基因推测参与乌头碱酰基化修饰,且在不同部位表达存在差异,推测ApTPS8高表达场所(根)是二萜生物碱前体合成的主要部位。结合乌头碱类成分在植物体内的分布规律,推测ApBAHD1/2/8参与2-羟基乌头碱、dehydrated 14-benzoylaconitine、8-O-methyl-14-benzoylaconine、benzoyldeoxyaconitine和benzoylaconitine的生物合成,ApBAHD10参与乌头碱、lucidusculine、14-O-acetylneoline、14-O-acetylvirescenin的生物合成。通过铁棒锤、乌头比较转录组分析,发现铁棒锤中二萜合酶和酰基转移酶基因家族发生明显的收缩,这与乌头碱类化合物种类和数量明显偏少的结果一致,提示铁棒锤为乌头碱类化合物生物合成途径研究的理想材料。本工作可为后续乌头碱生物合成途径解析、毒性形成分子机制的探讨、道地药材形成机制提供基础科学资料。