转化毛状根获得萝芙木生物碱的研究

药用植物萝芙木(Rauvolfia verticillata)的无菌苗被含有Ri质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染后,诱导出毛状根(Hairy root)。将毛状根分离、除菌后,在不含激素的MS固体或液体培养基上培养,从296个株系中筛选出RV 19、RV 26、RV 37和RV53四个生长速度快、分枝数量多等优良特性的无性系。对毛状根中次生代谢产物的提取和测定表明,四个无性系均含有原植物体所具有的吲哚生物碱。为应用转化毛状根技术获得植物次生代谢产物开辟了一条新的有效途径。

发根农杆菌介导云南萝芙木的遗传转化

用发根农杆菌A4分别感染云南萝芙木幼嫩的真叶和茎段,诱导出毛状根,并对毛状根进行了离体培养, PCR检测转基因毛状根和HPLC检测毛状根中利血平的含量．结果表明:这两种外植体的转化频率及诱导出的毛状根差异极大,幼嫩的真叶叶片比茎段更适合作转化外植体用．PCR检测结果表明,诱导毛状根的基因rolB和 rolC整合到云南萝芙木基因组中,HPLC含量检测表明毛状根中利血平的含量比自然根中利血平的含量有显著的增加,因此可以作为利血平来源生产的有效途径之一．

萝芙木属植物的物种和分布

对萝芙木属植物的物种及其分布进行了初步研究,目的在于弄清国际上的分类命名现状.结果表明:目前萝芙木属植物的分类比较混乱,还没有一个为国际所普遍接受的分类方法和命名系统,一些种类的分类地位和命名在国际上没有被认可.认为本属植物分类中世界公认的物种应予认可,一些国际权威机构认可的物种可以基本上认定.花和果实是这些植物最重要的分类特征.

高效液相色谱法测定萝芙木中育亨宾和利血平的含量

目的建立检测萝芙木中有亨宾和利血平含量的高效液相色谱分析方法。方法采用C18色谱柱，流动相A为甲醇-水-三氟乙酸（30：70：0．1），流动相B为甲醇-水-三氟乙酸（55：45：0．1），阶段洗脱，流速为1mL／min，检测波长为230nm结果育亨宾、利血平在10～200μg／mL浓度范围内呈良好的线性关系，加样回收率、精密度、稳定性、重复性良好。结论此法灵敏准确，可用于萝芙木中育亨宾、利血平的含量测定。

加速溶剂萃取(ASE)技术提取海南萝芙木活性成分

考察了加速溶剂萃取(ASE)技术对海南萝芙木抗氧化活性成分的提取效果。以提取物对DPPH自由基的清除率为指标,确定水-丙酮混合溶剂为最佳溶媒,通过正交实验确定了最佳提取条件,即样品经质量分数1%的盐酸预处理30 m in后,以V(丙酮)∶V(水)=1∶1为溶媒,在125℃用加速溶剂萃取仪提取,所得提取物对DPPH自由基的清除率为89.378%,而索式提取法仅为68.45%。表明加速溶剂萃取技术可以作为萝芙木中活性成分的一种高效提取手段。

IBA和GA_3与温水浸种对催吐萝芙木种子发芽的影响

采用L9（34）和L8（27）的正交设计,了解IBA和GA3与温水浸种对催吐萝芙木种子发芽的影响。结果表明,催吐萝芙木种子平均发芽率和发芽势分别为0.0%-37.7%和0.0%-23.7%,处理组合间呈现极显著的差异。IBA和GA3是影响催吐萝芙木发芽率和发芽势的主导因子,低浓度的IBA（0.25 g/L）和高浓度的GA3（1.00 g/L）与40-60℃的温水配合依次浸种,可极显著提高发芽率和发芽势。

ICP-MS测定中药萝芙木中微量元素的含量及形态分析

采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定了中药萝芙木中9种微量元素的含量及形态分析.样品采用去离子水浸提,HNO3-H2O2电炉加热消解,电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定,用茶叶标准物质对测定方法的准确度进行验证,初步探究微量元素的存在形态.结果显示萝芙木中9种微量元素的总含量大小为Zn〉Mn〉Pb〉Fe〉Cu〉Cr〉As〉Ni〉Cd,水提液中各元素的含量大小为Zn〉Mn〉As〉Ni〉Cr〉Pb〉Cd,Fe和Cu未检出.水提残渣态中各元素的含量为0.014-9.643μg/g,水提液中Zn、Mn、Cr、As、Ni元素都存在可溶有机态和可溶无机态,有机态与无机态的比率值在28.12%-264.55%之间,其中Zn、Cr、Ni的有机态大于无机态,比值大于166.67%;颗粒吸附率在7.69%-125%之间.萝芙木中9种微量元素是以多种形态共存的复杂体系.

绿春萝芙木资源薄层色谱鉴别

根据形态学特征对绿春县萝芙木(Rauvolfia L.)资源进行鉴定,同时采用薄层色谱法进行色谱鉴别.结果表明,绿春产萝芙木分别为萝芙木Rauvolfia vericillata(Lour.)Bail.和云南萝芙木Rauvolfia yunnanensisTsiang,两者色谱特征差异明显,但两者均含有药用成份利血平(reserpine)和育亨宾(yohimbine),开发时应综合利用.

云南萝芙木叶愈伤组织诱导与植株再生

研究了云南萝芙木叶愈伤组织的诱导及器官发生条件.结果表明:诱导愈伤组织的培养基为MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L;诱导愈伤组织芽分化和增殖的培养基分别为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L和MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;根分化的最适培养基为1/2 MS+NAA 0.8 mg/L;生根苗经练苗后移栽,成活率达90%,生长良好.

DPPH·体外清除实验研究萝芙木水溶性生物碱抗氧化活性

目的研究萝芙木水溶性生物碱(WSAR)的抗氧化活性。方法根据DPPH.体系吸光值的变化研究催吐萝芙木水溶性生物碱清除自由基的能力,DPPH.反应体系为2.5 ml 6.5×10-5mol.L-1DPPH.+0.5 ml样品溶液,反应时间30min。考察了不同浓度WSAR和特丁基对苯二酚(TBHQ)与DPPH.自由基清除率的关系。结果DPPH.自由基的清除能力IC50(WSAR)=2.627×10-4g/ml,IC50(TBHQ)=1.267×10-5g/ml。结论萝芙木水溶性生物碱具有抗氧化活性,可以开发为天然抗氧化剂。

UPLC法测定萝芙木根中的利血平含量

采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×150mm,1.7μm),流动相为甲醇-水-三乙胺(68∶32∶0.01),流速为0.2mL·min-1,柱温40℃,检测波长为267nm,UPLC方法测定萝芙木中利血平的含量。利血平在0.0233—0.466μg范围内有良好的线性关系(r=0.9994),平均回收率(n=6)为99.5%。该方法快速、准确、重复性好,为萝芙木的质量控制提供了一种快速准确的检测方法。

催吐萝芙木内生菌Bacillus subtilis LYM3的抑菌活性产物

为了研究分离自催吐萝芙木的内生细菌Bacillus subtilis LYM3的抑菌谱及其产生的抑菌活性产物,利用对峙生长法测试了菌株LYM3对10种植物病原真菌的拮抗活性,利用Sephadex LH-20凝胶柱对其产生的抑菌活性产物进行了分离,并利用LCMS-IT-TOF进行了初步鉴定。结果显示:菌株LYM3对10种植物病原真菌均有较强的拮抗作用,抑制率均在60%以上,其中对香蕉炭疽病菌的抑菌活性最强,抑制率为83.5%;LYM3产生的抑菌物质主要为胞外产物,具有较好的热稳定性,在p H 6~12活性稳定;经分离发酵液获得3种抑菌活性组分A、B和C,经初步鉴定推测A属于伊枯草菌素,B和C属于表面活性素。可见,菌株LYM3具有广谱抗菌性,其产生的抑菌活性产物主要为脂肽类物质。

海南催吐萝芙木生物碱的研究

采用醇提法对海南催吐萝芙木的生物碱化合物进行了提取分离,并采用大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20等反复柱层析手段及重结晶法对浸膏进行了分离纯化,得到了3个单体化合物,同时通过理化性质和现代分析测试技术(如IR,LC-MS,~1H-NMR,^(13)C-NMR,~1H-~1HCOSY,HSQC,HMBC等)确定了各化合物的结构,它们分别被鉴定为:利血平、利血匹林、萝芙木新碱,其中,萝芙木新碱为首次从该植物中分离得到的化合物,为新化合物.

从催吐萝芙木中提取利血平和育亨宾的工艺研究

研究从催吐萝芙木中提纯利血平和育亨宾的工艺。催吐萝芙木根粉用酸性乙醇水溶液浸提,正交实验法确定浸提条件为:浸提2次、每次3 h、浸提剂含50%乙醇0、.05 mol/L硫酸。浸提液经HZ-818大孔吸附树脂吸附,用40%乙醇溶液(含1%HCl)解吸育亨宾,用80%乙醇溶液(含1%HCl)解吸利血平,育亨宾和利血平得到完全分离。两种解吸液分别经过沉淀、结晶,得到利血平和育亨宾。所得利血平纯度为99.8%,总收率为27.1%;育亨宾纯度为4.9%,总收率为9.8%。本工艺能从催吐萝芙木中提取利血平和育亨宾,有利于充分利用中药材,降低成本。

云南萝芙木异胡豆苷合成酶基因的克隆与分析

以云南萝芙木叶片为材料,通过RT-PCR方法首次克隆了云南萝芙木萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,TIAs)次生代谢的合成途径中重要的限速酶——异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase,STR)的基因并进行了生物信息学分析。生物信息学分析表明,该基因的编码区长度为1 038 bp,编码345个氨基酸的多肽,等电点为5.06,N-端有一长度为27个氨基酸参与分泌的信号肽。二级结构预测指出,延伸链和不规则盘绕是STR蛋白质最大量的结构元件,而α-螺旋和β-转角则散布于整个蛋白质。同源性分析则表明,云南萝芙木中的STR和其它植物来源的STR同源,使用MEGA5.1构建了植物的STR分子系统进化树。

高效液相色谱法测定萝芙木中5种吲哚类生物碱的含量

目的建立同时测定萝芙木中的5种吲哚类生物碱含量的方法。方法采用Diamonsil C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温25℃,流动相为甲醇-水(梯度洗脱),流速1 m L·min^(-1),检测波长280 nm,进样量5μL。结果萝芙木中蛇根精、育亨宾、萝芙木碱、阿马里新、利血平5种吲哚类生物碱在1.56~200.0μg·m L^(-1)范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999 0,5种吲哚类生物碱的平均回收率为95.0%~105.0%(n=9)。结论该方法简单,结果准确、重复性好,可用于萝芙木药材的质量控制。

高温对萝芙木细胞膜、膜脂和抗坏血酸代谢造成的损伤

通过高温胁迫下萝芙木叶片电导率、膜脂过氧化物丙二醛(MDA)、自由基清除剂抗坏血酸的变化研究,探讨高温对萝芙木组织造成的损伤及自由基清除剂代谢的影响,从而揭示高温胁迫下萝芙木生长发育迟缓的原因。结果表明,热胁迫对萝芙木细胞膜造成损伤,使膜脂更多地被过氧化,抗坏血酸含量下降,致使萝芙木受到热损伤和氧化损伤,最终可能使其生长发育放缓,开花结果推迟。研究还表明,萝芙木经适当高温(37℃)热驯,能产生较多的抗坏血酸,以清除热胁迫诱导产生的氧自由基,降低氧化损伤程度。

云南萝芙木中三种生物碱含量的HPLC法测定

运用高效液相色谱法(HPLC)测定云南萝芙木中育亨宾、阿吗碱、利血平3种生物碱的含量。采用岛津VP-ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为甲醇-(0.004 mol/L二乙胺)水系统,梯度洗脱,流速为1 mL/min,检测波长278 nm,柱温30℃。结果表明,育亨宾在0.140～0.700μg(r=0.999 1)、阿吗碱在0.096～0.480μg(r=0.998 7)、利血平在0.104～0.520μg(r=0.998 8)范围内呈现良好的线性关系,平均加样回收率分别为96.4%、95.5%、96.3%,变异系数分别为1.15%、0.48%、1.14%。该方法可同时检测萝芙木根中育亨宾、阿吗碱、利血平3种生物碱,准确,快速,简便。

不同水分和施氮量对催吐萝芙木光合特性和生长的影响

g·株-1)]对两年生催吐萝芙木(Rauvolfia vomitoria Afzel.)生长和光合的影响。结果表明:水分胁迫显著降低了催吐萝芙木叶片相对含水量(LRWC),但LRWC仍在85%以上,属于低度水分胁迫,其最大净光合速率、气孔导度、比叶面积、茎重比以及株高、基径和生物量的相对生长速率均较无水分胁迫时低。水分胁迫下,低量施氮可使最大净光合速率、蒸腾速率、根重比升高,使株高、基径和生物量的相对生长速率增加,从而明显增加最终根产量;而高量施氮则会增加幼树对干旱的敏感性,加重干旱对催吐萝芙木光合和生长的抑制作用。水分与施氮量交互作用对催吐萝芙木叶片相对含水量、最大净光合速率、水分利用效率、比叶面积和根重比的影响显著,表明施氮量对其影响视水分胁迫状况而不同。因此,为获得催吐萝芙木最大根产量,应在干季收获期前少量施用氮肥。

高效液相色谱法测定萝芙木中利血平的含量

建立了测定萝芙木属植物中利血平含量的高效液相色谱方法，用十八烷基键合硅胶柱，以四氢呋喃-甲醇-0．3％磷酸（30：15：55）为流动相，检测波长为268nm。结果表明萝芙木属植物中利血平含量在0．0012％～0．117％之间，以根部含量最高。就资源开发而言，催吐萝芙木、印度萝芙木的生物量和利血平含量均比云南萝芙木高，是较好的种植优势种。