甘露碱合成酶基因启动子调控的萤光素酶基因在转化烟草中的表达

利用我们自己分离的甘露碱含成酶基因启动子与萤光素酶结构基因、胭脂碱合成酶基因’3末端结构相拼构成一融合基因,并在带有此融合基因的中间载体PBZ7610插入Ti质粒T区的tmr基因,构成中间载体pBZ7621。利用改建的Ti质粒载体PGV3850,将萤光素酶融合基因引入了烟草植株,结果表明,萤光素酶融合基因在转化烟草中能表达。中间载体pBZ7610还带有PstⅠ,HindⅢ,XbaⅠ等多个单一的酶切位点,外源基因极易插入。利用中间载体pBZ7621,还可研究启动子在高等植物不同发育阶段中的功能特征。

萤火虫萤光素酶基因构建BIV－LTR启动子表达研究体系

萤火虫萤光素酶基因构建ＢＩＶ－ＬＴＲ启动子表达研究体系刘国文，纪永刚，梁臣，刘淑红，陈启民，耿运琪（南开大学生命科学学院天津３０００７１）关键词萤光虫萤光素酶基因（ｌｕｃ），ＢＩＶ－ＬＴＲ，ＢＩＶ－ｔａｔ目前使用最广泛的报道基因是细菌的氯霉素乙酰转移...

萤火虫萤光素酶基因转化花叶芋及表达的研究

将萤火虫萤光素酶基因重组到质粒pBR325中,通过“三亲交配”和同源重组,将萤光素酶基因整合到Ti质粒pGV3850:1103。通过改良的叶盘转化法,用萤光素酶基因转化单子叶植物花叶芋,获得转基因植株。对再生植株的胭脂碱测定、新霉素磷酸转移酶分析、DNA点杂交、萤光素酶基因活性测定,证明萤光素酶基因已转化到花叶芋中并进行了表达。

含人DNA聚合酶β基因启动子萤光素酶报告载体的构建

目的:构建含人DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter。方法:利用PCR技术扩增人类polβ基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-Neo-enhancer,构建含DNApolβ启动子的萤光素酶表达载体pGL3polβ/promoter,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。将构建的载体用脂质体转染体外培养的食管癌EC-1细胞株,应用萤光素酶测定系统检测萤光素酶的表达活性。结果:测序结果表明,克隆获得的polβ基因启动子序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。pGL3polβ/promoter组萤光素酶的表达活性(2207348.000±71626.763)与空白组(451.670±23.347)和pGL3-Neo-enhancer组(4884.330±1623.047)相比,差异有统计学意义(F=5681.596,P<0.05)。结论:成功构建了含人DNA polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter。

孕烷X受体应答元件萤光素酶报告基因的构建及活性检测

目的建立孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)应答元件萤光素酶报告基因,并检测其活性。方法利用化学合成方法得到五聚体PXR应答元件(everted repeat elelment-6,ER-6元件)5和(direct repeat element-3,DR-3)5序列;将五聚体PXR应答元件序列(ER6或DR3)克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测PXR应答元件报告基因的活性。结果 PXR应答元件萤光素酶报告基因具有明确的活性。PXR激动剂茴香霉素能够剂量依赖地诱导ER6-Luc(R2=0.95;P=0.002 2)和DR3-Luc(R2=0.96;P=0.000 91)报告基因的活性,其EC50值分别为(0.11±0.04)μmol/L和(0.13±0.06)μmol/L;PXR拮抗剂酮康唑能够剂量依赖地降低茴香霉素诱导的ER6-Luc(R2=0.97;P=0.000 85)和DR3-Luc(R2=0.98;P=0.000 11)的活性,IC50值分别为(0.71±0.11)μmol/L和(1.73±0.15)μmol/L。结论成功构建了PXR应答元件报告基因,建立了PXR转录活性的检测方法。

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的:克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法:采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4.0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果:构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论:克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。

萤光素酶报告基因细胞模型在筛选靶向调控RAC1的大黄酸衍生物中的应用

目的 构建含RAC1启动子萤光素酶报告基因CNE1-RAC1-Luc2稳转细胞模型,探讨其在转录水平筛选靶向调控RAC1抗肿瘤活性的大黄酸衍生物中的应用。方法 利用RAC1启动子序列,设计合成萤光素酶报告基因-慢病毒重组载体,感染鼻咽癌CNE1细胞,获得稳定表达萤光素酶的细胞;采用萤光素酶报告基因检测试剂盒,检测RAC1激活剂PMA和抑制剂NSC23766刺激该细胞后的萤光素酶发光值,并观察系列大黄酸衍生物对RAC1启动子萤光素酶活性的影响,Western blot验证细胞RAC1蛋白表达的变化。结果 双酶切实验显示,含RAC1启动子萤光素酶报告基因的慢病毒表达载体构建成功;经嘌呤霉素筛选,获稳定表达萤光素酶的CNE1-RAC1-Luc2细胞,转染效率达90%以上;RAC1萤光素酶报告基因检测系统对RAC1激活剂和抑制剂反应灵敏,萤光素酶活性与Western blot实验中RAC1蛋白表达结果一致;系列大黄酸衍生物对CNE1-RAC1-Luc2细胞萤光素酶活性的调控作用与Western blot结果基本一致。结论 成功构建了含RAC1启动子的萤光素酶报告系统的细胞模型,为高通量进行靶向RAC1药物的筛选提供一个实用的平台。

含表皮生长因子受体(EGFR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌细胞模型的建立

目的建立稳定表达人表皮生长因子受体(EGFR)启动子及萤光素酶(Luc)报告基因的三阴性乳腺癌细胞系,并对其应用进行初步验证。方法采用基因重组技术,构建含有EGFR启动子以及Luc报告基因的慢病毒载体,并感染MDA-MB231细胞,经过嘌呤霉素筛选获得能稳定表达Luc活性的MDA-MB231-EGFR-Luc2细胞系;分别采用EGFR激活剂EGF以及抑制剂吉非替尼处理细胞后检测Luc活性变化。结果通过基因测序和质粒双酶切鉴定,EGFR基因启动子Luc报告基因-慢病毒表达载体构建成功,经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达Luc的MDA-MB231-EGFR-Luc2细胞;EGF可剂量依赖性的增加细胞中Luc的活性,而吉非替尼则相反。结论建立了MDA-MB231-EGFR-Luc2稳定表达EGFR启动子及Luc报告基因细胞系,为高通量筛选靶向EGFR的抗肿瘤药物提供一类新的细胞模型。

T细胞活力响应性启动子(TARP)萤光素酶报告系统在CAR⁃T细胞功能鉴定中的应用

目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病毒包装并感染人原代T淋巴细胞,流式细胞术检测慢病毒感染T细胞的阳性率。通过萤光素酶报告基因系统、Western blot法、流式细胞术、小动物活体成像技术鉴定CAR⁃T细胞的功能。结果酶切鉴定和质粒测序结果表明重组质粒的顺利构建,流式细胞术结果显示CAR⁃T细胞的正常制备,萤光素酶活力检测结果表明本系统能够动态响应CAR⁃T细胞的激活,体外功能实验证实本系统能够反映CAR⁃T细胞的耗竭状态,小动物活体成像结果体现了本系统在小鼠体内的示踪功能。结论TARP纳米萤光素酶报告基因系统为评估CAR⁃T细胞活化水平,耗竭状态以及体内示踪等方面提供了更加便捷、灵敏、定量分析的技术手段。

血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的:构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1α(HIF-1α)结合VEGF启动子的区域。方法:以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1α表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1α结合VEGF启动子的区域。结果:测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128^-728 bp片段是HIF-1α与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论:克隆了VEGF启动子5'端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。

携带萤光素酶报告基因细胞筛选靶向RAC1的含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物

目的:采用携带RAC1启动子基因片段及萤光素酶报告基因的肺癌细胞株A549-RAC1-Luc2,筛选靶向抑制RAC1表达的含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物。方法:运用分子对接软件MOE分析含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物与RAC1结合能力。采用MTT法检测目标化合物对肺癌A549细胞生长活性的抑制作用;以无细胞毒浓度的含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物处理A549-RAC1-Luc2细胞后,采用萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞萤光素酶活性变化,Western blotting法检测各组细胞RAC1蛋白的表达水平。结果:合成的系列含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物4A、4B、4H、4L、4C、4D、4E均能抑制肺癌A549细胞增殖,其半数抑制浓度IC50均明显低于先导化合物Rhein(P<0.01);RAC1激活剂PMA和抑制剂NSC23766可调控A549-RAC1-Luc2细胞的萤光素酶活性(P<0.01),含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物4D、4E能抑制细胞萤光素酶活性及RAC1蛋白的表达,且4D、4E处理后A549-RAC1-Luc2细胞中萤光素酶的表达量明显低于使用RAC1抑制剂NSC23766处理的细胞(P<0.01),且与RAC1结合亲和力最强、稳定性最高。结论:含RAC1启动子及萤光素酶报告基因的肺癌细胞模型可筛选靶向RAC1的抑制剂,含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物4D、4E可能是潜在的RAC1抑制剂。

细胞色素氧化酶3A4启动子报告基因的构建及其活性检测

目的建立细胞色素氧化酶(cytochrome P-450,CYP)3A4启动子报告基因并在孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)表达阳性的肿瘤细胞中检测其转录活性。方法利用PCR扩增CYP 3A4的启动子区远端调控序列(-7836/-7208)和近端调控序列(-362/+52)序列;将上述序列克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测CYP 3A4报告基因的活性。结果在肝癌细胞系中,PXR的激动剂利福平能够剂量依赖性地诱导远端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.92;P=0.003 4)和近端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.95;P=0.011)的活性,EC50为(5.65±0.58)μmol/L和(8.91±1.12)μmol/L;PXR的拮抗剂酮康唑能够剂量依赖性地抑制利福平诱导的远端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.92;P=0.003 4)和PXRELuc(R2=0.92;P=0.003 4)活性,IC50为(0.55±0.08)μmol/L和(0.94±0.14)μmol/L。此外,多种化疗药物(PXR的潜在配体)能够在PXR阳性的肿瘤细胞系中诱导远端调控序列荧光素酶报告基因和近端调控序列荧光素酶报告基因的活性。结论成功构建了CYP 3A4启动子报告基因,在此基础上建立了在不同肿瘤细胞中检测PXR转录活性的方法。

人TANK结合激酶1的基因克隆、表达及生物活性鉴定

目的:克隆人TANK结合激酶1(TBK1)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:应用RT-PCR方法,以HeLa细胞RNA为模板,扩增获得TBK1基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中,以LipofectAMINE2000转染试剂转染pcDNA-Flag-TBK1至293细胞中进行瞬时表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,从人HeLa细胞总RNA中克隆到正确的TBK1基因全长编码序列,利用Western印迹检测其在293细胞中获得有效表达,利用萤光素酶报告基因实验检测TBK1可以诱导IFN-β转录激活。结论:真核表达的人TBK1具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的:克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法:采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果:克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329～2174bp间存在正调控序列,在2174～4661bp间存在负调控序列。结论:构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。

NF-κB结合位点在LPS诱导人TNF-α基因转录中的调节作用

为探讨人TNF α基因启动子区域NF κB结合位点对LPS诱导性基因表达的调节作用 ,将构建的含人TNF α基因启动子区域及其不同缺失片段的pGL2萤光素酶报道基因重组体 ,体外转染HL 60细胞 ,观察LPS刺激对TNF基因启动子指导萤光素酶表达的影响 .发现TNF α基因启动子区域的 3个NF κB结合位点的存在是该基因最大组成性表达和LPS诱导性表达所必需 ;将这 3个位点缺失可完全阻断报道基因的LPS诱导性表达 ,并使其组成性表达明显受到抑制 (P <0 .0 0 1) .缺失κB1和κB2位点 ,使基因组成性表达与LPS诱导性表达均减少约 50 % (P <0 .0 1) ,但诱导倍数则与非突变体相近 ;反之 ,用κB3反义寡核苷酸封闭κB3位点 ,保留κB1和κB2功能 ,使LPS诱导性基因表达抑制 70 % (P <0 .0 0 1) ,诱导倍数明显降低 .保留原有κB3位点 ,再将κB3位点取代κB1和κB2位点 ,可使基因组成性和诱导性表达几乎完全恢复 ;将κB3位点向TSS移近 (- 98→ - 52 ) ,取代Sp1位点 ,虽然κB1和κB2位点仍然缺失 ,但仅一个κB3位点即可使基因组成性和LPS诱导性表达恢复到 80 % .用反义寡核苷酸封闭这个κB3位点 ,不但可使TNF α启动子完全丧失对LPS的反应性 ,还可完全阻断所控基因的组成性表达 .结果表明 ,人TNF α启动子区域 3个NF κB位点均参与该?

人DNA聚合酶β基因启动子碱基位点突变对萤光素酶表达的影响

目的观察人DNA聚合酶B基因（DNApolymerasebeta，polB）启动子-37位C→A突变对萤光素酶表达的影响。方法从25例人正常食管黏膜及食管癌组织中提取基因组DNA，PCR扩增及测序分析，获得野生型及含-37位C→A的突变型polβ启动子序列。分别构建含人野生型和突变型的polβ启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3（W／M）polβ／promoter，转染食管癌细胞Eca9706及G418筛选，检测萤光素酶活性。结果野生型及突变型的polβ启动子片段正确插入萤光素酶报告载体pGL3-neo-enhancer。对照组pGL3-neo-enhancer、野生组pGL3Wpolβ／promoter和突变组pGL3Mpolβ／promoter萤光素酶活性分别为2743．50±227．30、1112976．00±82900．20和7882559．00±201824．90，三组间差异有统计学意义（P〈0．01）。结论polβ基因启动子对萤光素酶基因表达具有较强的启动活性，polβ启动子区-37位C→A碱基突变可显著增强萤光素酶的表达。

花色苷对LO2细胞核受体报告基因的影响

研究花色苷矢车菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-β-D-glucoside,C3G)及其苷元矢车菊素(cyanidin)对代谢综合征紧密相关的一系列核受体转录活性的影响。将维甲酸X受体(RXR)、孕烷X受体(PXR)、雌激素受体(ER)、法尼醇X受体(FXR)、肝脏X受体α和β(LXRα,LXRβ)、3种过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARα、PPARγ、PPARδ)等核受体-萤光素酶报告基因和绿色荧光蛋白基因内参转染至人肝细胞LO2建立模型,分别以1、10、100μmol/L的Cyanidin或C3G干预培养细胞24h,筛选可被Cyanidin或C3G激活的核受体类型。结果显示,与溶剂对照组(0.1%DMSO)相比,3种浓度的Cyanidin对RXR都有抑制作用,但是仅在100μmol/L浓度条件下对PXR有较弱的激活作用(1.42±0.19,P<0.05);C3G则对PXR、ER、LXRα、LXRβ、PPARγ、PPARδ等多种核受体有激活作用(P<0.05),其中对PXR、LXRα、LXRβ、PPARγ等核受体的激活倍数超过对照组50%以上。实验结果提示,花色苷改善代谢综合征的作用机制可能与它对一系列细胞核受体的激活作用有关;比较Cyanidin和C3G对核受体的激活能力,发现C3G的作用效果强于其苷元Cyanidin。

中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的研究

目的研究中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的作用。方法构建含完全甲基化GSTP1启动子区的重组质粒pGL3-GSTP1prom并转染MCF-7细胞,分别用不同剂量的CDP和5-aza-C作用细胞,检测表达的萤光素酶活性。观察GSTP1启动子转录活性的变化。结果GSTP1启动子区被完全甲基化后转录活性显著降低;CDP能够逆转高甲基化状态下GSTP1基因启动子区的低转录活性且呈剂量依赖关系。结论中药成分CDP能够逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子区的低转录活性。

利用报告基因的人7型腺病毒中和抗体检测方法的建立

目的:构建表达萤光素酶报告基因的重组人7型腺病毒(HAdV7)Ad7-dE1-dE3-Luc(Ad7-Luc)病毒,用于检测人群中HAdV7的中和抗体水平。方法:利用同源重组方法构建E1区和E3区部分缺失,并在E1区嵌入萤光素酶基因表达框的pAd7-Luc重组质粒,转染HEK-293细胞,包装出能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7载体重组病毒(Ad7-Luc);选取HAdV7阳性血清样本对新建立的报告基因检测方法的准确性和稳定性进行验证;最后,利用该方法对北京地区60份血清样本进行HAdV7中和抗体检测。结果:获得能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7-Luc重组病毒,病毒滴度可达4.85×10~8IFU/mL,Ad7-Luc检测法与传统细胞病变效应(CPE)法具有很好的一致性(R^2=0.8612,P<0.0001),批内和批间差异分别在10%和20%以内。北京地区60例血清样本的检测结果显示,HAdV7血清阳性率约为60%(36/60),明显低于HAdV5血清阳性率75%(45/60),75%的HAdV7阳性血清中和抗体滴度集中于低滴度水平(12～200)。结论:与传统的细胞病变方法相比,HAdV7中和抗体报告基因检测方法更快速、灵敏、准确,适用于人群中HAdV7血清流行病学调查及其疫苗的中和抗体研究。

基于GADD153启动子的环境致癌物快速筛选系统研究

[目的]构建快速检测环境中痕量致癌物DNA损伤效应的重组人肝细胞株。[方法]构建含生长抑制与DNA损伤基因153(GADD153)启动子和萤光素酶报告基因的重组稳定转染人肝肿瘤HepG2细胞;发光检测不同致癌物对稳定转染细胞的DNA损伤效应;同时RT-PCR检测内源性GADD153mRNA的表达;彗星试验(Cometassay)检测DNA的损伤效应。[结果]稳定转染GADD153-LUC细胞株可检出多环芳烃、芳香胺、重金属、农药等已知环境致癌物以及实际水样中的含量。检测结果与彗星试验结果相比,大多数检测下限均低于彗星试验的检测限,其中对苯并芘、氯化镉和2-氨基芴的检测灵敏度分别高于彗星试验1000、300和100倍;对Aems试验不敏感的重金属、四氯化碳、氟化钠等重组细胞株具有较高的检测灵敏性。10μmol/L的氯化镉可诱导内源性GADD153mRNA和萤光素酶活性表达增加,相关分析表明两者具有良好的相关性(r2=0.9539)。[结论]重组细胞株GADD153-LUC细胞可快速检测环境中痕量污染物的DNA损伤效应。