人CXCR4基因启动子萤光素酶报告载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人CXCR4基因启动子萤光素酶报告载体,为AIDS的靶向基因治疗奠定基础。方法利用PCR技术扩增人CXCR4基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-neo,构建含CXCR4启动子的萤光素酶表达载体pGL3-neo-CXCR4,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。再将构建的载体用脂质体转染体外培养的Jurkat细胞株,检测萤光素酶的表达活性。结果扩增得到CXCR4基因启动子序列,克隆入pGL3-neo-CXCR4的CXCR4基因启动子序列与GenBank报道的一致,实验组(pGL3-neo-CXCR4组)萤光素酶的表达活性为869 159.0±62 618.8,与空白组(未转染组)的464.2±44.0和对照组(pGL3-neo组)的39 088.4±3867.9相比,差异有统计学意义(F=1415.124,P均<0.05)。结论成功构建了含人CXCR4基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3-neo-CXCR4。

带新霉素抗性的萤光素酶报告载体的构建

目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体。方法:设计扩增新霉素抗性基因neo,克隆入萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo。分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性。结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光素酶报告质粒pGL3-neo。G418筛选可获得稳定转染pGL3-neo细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株。荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMVpromoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMVpromoter组萤光素酶活性值分别为1047±86、1504±107和34819±1479、456109±15791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05。结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高。

食管癌EC-1细胞株polβ启动子突变性转录活性分析

目的探讨食管癌细胞EC-1中DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的突变对其转录活性的影响。方法提取正常永生化细胞293T和EC-1细胞基因组DNA,PCR扩增及测序分析,获得293T细胞野生型及EC-1细胞含-137位和-166位点G→A突变的突变型polβ启动子序列,构建polβ启动子萤光素酶报告基因重组质粒pGL3-neo-293T-polβ/promoter(野生型)和pGL3-neo-EC-1-polβ/promoter(突变型),重组质粒分别转染EC-1、Eca9706或293T细胞株,氨基糖苷类抗生素G418筛选,检测各组萤光素酶活性。结果野生型及突变型的polβ启动子片段正确插入萤光素酶报告基因载体pGL3-neo-enhancer,成功构建polβ启动子萤光素酶报告基因重组质粒;在3个细胞株中,野生型和突变型重组质粒萤光素酶活性均高于对照组,突变型高于野生型,差异均有统计学意义(P<0.001);突变型重组质粒在EC-1、Eca9706或293T细胞株中的萤光素酶活性值分别为(544 429.5±26 741);(505 683±26 661.1);(415 569.33±32 602.7),差异有统计学意义(P<0.05或P<0.001)。结论食管癌细胞EC-1中DNApolβ基因启动子-137位和-166位点G→A突变可增强其启动子活性;突变型polβ启动子报告基因载体在食管癌细胞中启动子活性较高,提示食管癌细胞中可能存在使其突变型polβ启动子活性增加的作用因子。