两种萤火虫荧光素酶活性检测方法的一致性比较

目的:比较2种萤火虫荧光素酶活性检测方法的一致性。方法:分别采用化学发光技术(Che)及活体光学成像技术(Bio),从细胞和动物水平检测在转染以萤火虫荧光素酶为报告基因的载体pCI-AAA-Fluc-neo后不同时间点,萤火虫荧光素酶的表达强度。结果:在细胞和动物水平,萤火虫荧光素酶的表达强度均随时间推移逐步递减。在HepG2细胞,萤火虫荧光素酶表达持续96 h,活性从24 h的2781±220 mV(1.6×106±2.3×105光子)降至96 h的49±3.5 mV(6.4×104±2.5×104光子)。在动物水平得到相似的结果,BALB/c小鼠萤火虫荧光素酶表达持续20 d,其活性从1 d的16592±409 mV(1.9×108±3.6×106光子)降至20 d的798±139 mV(3.37×105±3.8×104光子)。通过一致性检验,2种检测方法在细胞和动物水平的直线回归方程分别为lgChe=1.186.lgBio-3.764(r=0.937,P<0.001)和lgChe=0.451.lgBio+0.64(r=0.915,P<0.001);进一步将理论数据与实验数据进行配对t检验,二者无统计学差异(P>0.05)。结论:2种检测方法是一致的;从整个实验过程来看,活体光学成像技术较化学发光法更为简便、直观,可量化地对同一个体连续检测,减少了个体间差异和实验动物用量。

氘代甲基萤火虫荧光素的全合成

以2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑为原料,经脱甲基、氘甲基化,与D-半胱氨酸盐酸盐水合物反应合成了新化合物——氘代甲基萤火虫荧光素,总收率46%,对映选择性100%,其结构经1H NMR,FT-IR和MS表征。

萤火虫荧光素酶法测定昆虫组织ATP含量

以测定柞蚕神经内分泌组织中ＡＴＰ含量为例，详细介绍了萤火虫荧光素酶法测定昆虫组织中ＡＴＰ含量技术。该技术具有灵敏度高、专一性强、简便、经济等优点。

化学合成的萤火虫荧光素的理化性质

萤火虫荧光素酶(luciferase,简称荧光素酶)发光系统是各类生物发光中研究得最深入,最透彻的一类,也是生物发光分析中应用得最广泛的一种。在国外,有关生物发光分析试剂都已商品化,而国内则很少,只有粗荧光素酶。荧光素是有关生物发光分析中必不可少的有机试剂。为此,我们研制了荧光素,并与国外产品作了比较。

荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法检测CAR-T细胞杀伤的方法学研究

目的:比较荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法两种杀伤实验方法在嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor-T,CAR-T)细胞针对不同性质靶细胞开展杀伤实验时的适用性。方法:针对两种不同性质的靶细胞(悬浮细胞和贴壁细胞),采用荧光染料双染流式法和萤火虫荧光素酶法开展CAR-T细胞的杀伤实验,比较实验结果的精确性和趋势的一致性。结果:荧光染料双染流式法在靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验中能检测到具有统计意义的显著杀伤(P<0.01),但在靶细胞为贴壁细胞的实验中差异不显著;萤火虫荧光素酶法在悬浮和贴壁两种靶细胞的杀伤实验中都能检测到显著的杀伤(P<0.01)。结论:荧光染料双染流式法更适合靶细胞为悬浮细胞的杀伤实验,而萤火虫荧光素酶法对悬浮细胞和贴壁细胞都适合,因此在具体应用过程中应注意区别对待。

重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达

目的构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron,并观察其在非小细胞肺癌细胞株PC-9转染后对萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶表达。方法以双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板,PCR扩增后插入到psiCHECK-2质粒中,即获得重组双荧光素酶报告基因质粒psi-CHECK-2-Intron。取psiCHECK-2-Intron质粒,转染至感受态大肠杆菌中,采用琼脂糖凝胶电泳实验观察目的基因片段长度,并对目的基因片段进行基因测序。将重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron、双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2分别转染至PC-9细胞中,记为转染组、对照组,采用qRT-PCR法检测两组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA,采用双荧光素酶活性实验检测两组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性。结果目的基因片段长度为133 bp,基因序列正确,无突变和缺失,表明重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建成功。转染组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA的相对表达量分别为2.213±0.038、2.004±0.025,对照组分别为1.004±0.012、1.003±0.010,两组相比,P均<0.05。转染组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性分别为2.974±0.099、1.948±0.052,对照组分别为1.000±0.018、1.000±0.020,两组相比,P均<0.05。结论成功构建了重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron;psiCHECK-2-Intron转染PC-9细胞后,细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达均升高。

萤火虫荧光素酶标记结直肠癌模型的建立

针对小鼠结直肠癌细胞(CT26)构建能够稳定表达萤火虫荧光素酶Firefly luciferase(Fluc)以及具有嘌呤霉素抗性的CT26-Fluc细胞株,并建立其荷瘤鼠模型。采用同源重组技术将Firefly luciferase基因片段整合至转座子系统中得到质粒,将所得质粒转染进入CT26原始细胞株,使其在该细胞内表达。后通过细胞敏感性实验获得CT26最低致死浓度,筛选获得稳定表达荧光素酶的CT26-Fluc单克隆细胞系。流式细胞仪检测CT26-Fluc单克隆的纯度。同时利用显微观察等方法证实细胞增殖和细胞形态与CT26原始细胞系不存在显著差异。将构建成功的CT26-Fluc植入BALB/c小鼠右后侧背部皮下,通过小动物活体成像仪验证该细胞系能稳定表达荧光素酶,且能够用于小鼠结直肠癌成瘤模型。本实验成功构建了稳定表达Firefly luciferase的CT26-Fluc细胞系,为小鼠结直肠癌模型及其病灶转移机制的研究建立了技术基础。

萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌的构建与应用

目的:构建稳定表达萤火虫荧光素酶(Luc)的马尔尼菲篮状菌(TM),并进行生长状况和毒力的评估,为TM研究提供新手段和新工具。方法:构建Luc基因表达质粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-Luc,通过琼脂糖凝胶电泳和测序手段验证质粒是否携带Luc基因。采用农杆菌介导转化法将Luc插入TM基因组,在含有潮霉素培养基上筛选转化成功的TM转化子(TM-Luc)。于PDA培养基(27°C)中连续培养TM标准株ATCC18224和TM-Luc 14 d,记录二者的生长情况,挑取单个菌落进行乳酸酚棉蓝染色,荧光显微镜下观察两种菌株的形态。利用RT-qPCR和流式细胞术检测TM标准株和TM-Luc对THP-1来源巨噬细胞的杀伤情况。结果:经潮霉素筛选与电泳验证,得到稳定表达Luc的TM-Luc转化子。TM-Luc与荧光素底物结合后可发出荧光。在PDA培养基(27°C)连续培养14 d后,TM标准株菌落直径为(6.54±0.22)cm,TM-Luc菌落直径为(6.45±0.23)cm。两者表面均呈扁平绒毛状,并产生红色色素,生长曲线(P=0.273)与生长速率曲线(P=0.49)均无统计学差异(均P>0.05)。荧光显微镜镜下TM标准株和TM-Luc形态相似。流式细胞术显示TM标准株对THP-1来源的巨噬细胞杀伤作用较强于TM-Luc,在48 h时差异具有统计学意义(P=0.0156),在72 h时差异无统计学意义(P=0.1033)。炎症因子TNFA(24 h P=0.1529,48 h P=0.1115)与IL1B(24 h P=0.1338,48 h P=0.6921)在24 h、48 h表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:TM-Luc与TM标准株形态学与功能学特征相似,可作为工具菌用于细胞感染和动物感染模型上,以便于更加直观地评估TM与宿主间的相互作用。

基于稳定表达萤火虫荧光素酶Vero细胞系体外病毒中和活性检测方法的建立及应用

目的建立一种基于稳定表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)Vero细胞系的高通量检测方法,以评估样品的体外抗病毒中和活性。方法基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9靶向基因编辑技术,构建一种稳定表达fluc的Vero细胞系,在此基础上建立痘病毒和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染细胞活性检测方法,利用该方法评估痘病毒免疫血清及RSV单抗的中和活性,并与噬斑抑制法及细胞活力检测(adenosine triphosphate,ATP)法检测结果进行比较。结果成功构建了Vero-fluc细胞系,其细胞量与表达的fluc相关性良好(R^(2)=0.9948)。利用Vero-fluc细胞作为感染细胞验证的痘病毒中和活性检测方法具有良好的稳定性、可靠性[信噪比(signal/background ratio,S/B)=25],可满足高通量的检测需求(Z’=0.9),相比传统噬斑抑制法一致性强(R2=0.76),免疫血清的ID50值较噬斑法平均高出2倍。建立的RSV中和活性检测方法,检测的抗RSV单抗中和活性与ATP活性试剂盒检测结果一致,Vero-fluc细胞法在1∶103~1∶105的抗体滴度水平上抑制率显著高于ATP法。结论建立的基于Vero-fluc细胞系的病毒中和活性检测方法与传统方法相比,具有良好的相关性,结果可靠,且具有更高的灵敏度及检测通量,是一种通用型体外抗病毒中和活性评价方法。

小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在P19细胞中的表达。方法采用PCR方法获得WNT1基因启动子最小功能单位和3'UTR区域在内的DNA片段。双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受WNT1启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL-SV40(表达海肾荧光素酶)共转染P19细胞,24 h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,空白对照组(荧光强度比值:2.820 4±0.294 4)与对照组(荧光强度比值:3.050 8±0.303 7)及WNT-3'UTR突变组(荧光强度比值:51.475 8±0.983 7)比较,差异均有统计学意义(Pa<0.001),该重组表达载体在P19细胞特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建小鼠WNT1基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在P19细胞的特异性表达。

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体，并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283），双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体，使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元，24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确，该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体，并检测到该载体在神经元中的特异性表达。

基于萤火虫荧光素酶报告基因检测凋亡的系统构建及鉴定

为构建一个能够快速检测凋亡的含荧光素酶报告基因(Fluc)的真核表达质粒,采用PCR的方法将Caspase-3的识别基序Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)四个氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之间;同时选取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG)四个氨基酸作为阴性对照。随后重组片段分别克隆至分离型内含肽的N端和C端之间,并命名为pFluc-DEVD和pFluc-DEVG。将该表达质粒与海肾荧光素酶报告质粒(RLUC)同时转染至HeLa细胞,通过双荧光素酶报告基因和Western blotting实验检测细胞凋亡水平。双荧光素酶报告基因系统实验结果显示,当发生凋亡时,pFluc-DEVD质粒组表达的萤火虫荧光素酶的含量高出pFluc-DEVG质粒组约3倍。Western blotting检测结果显示,转染pFluc-DEVD质粒的细胞在凋亡药物刺激后,Fluc活化的蛋白显著增多,且Caspase-3 的活化程度与Fluc的表达呈正相关,并有显著的统计学差异。以上结果表明,pFluc-DEVD真核表达质粒表达的萤火虫荧光素酶蛋白能被细胞内的Caspase-3酶裂解,且该质粒能够精确地反映出细胞的凋亡水平,为后续进行凋亡定量检测提供了一个可借鉴的方法。

萤火虫氧化荧光素及其衍生物的电子结构和光物理性质

通过密度泛函理论(DFT)的MPW3PBE泛函,对萤火虫生物发光底物氧化荧光素及其衍生物进行了结构全优化.计算了其电离能、电子亲和势、空穴抽取能、电子抽取能、空穴和电子重组能,并评估了其空穴和电子传输能力.采用含时密度泛函理论(TD-DFT)//MPW3PBE/6-31+G(d)方法计算了吸收光谱,优化了最低单重态S1,研究了其荧光光谱,进而考察了具有较高发光效率的氧化荧光素作为有机发光二极管(OLED)材料的可能性.计算结果表明,氧化荧光素及其衍生物可以同时作为电子传输层和发光层材料.

萤火虫氧化荧光素类似物电子光谱的理论研究

对萤火虫氧化荧光素(S)-2-(6-羟基-2-苯并噻唑基)-2-噻唑啉-4-酮(BTZ)中苯并噻唑环的N和S原子进行取代,形成一系列萤火虫氧化荧光素类似物,并采用TD B3LYP/6-31+G(d)方法,通过计算氧化物中性态与羟基去质子化后的负一价态在气相、水溶液和模拟生物环境下的吸收与发射光谱,讨论环内不同取代原子对光谱的影响.结果表明,X1位以O原子取代S原子的化合物的最大吸收值发生蓝移,以N原子取代S原子的化合物的最大吸收值发生红移.去质子化可增加苯环上π轨道成份,降低能隙,从而有利于提高电子跃迁几率,使荧光发射波长红移;通过取代X1和X2位杂原子,可调节发射光谱红移达44 nm,蓝移达41 nm(在模拟蛋白中).6种化合物荧光发光范围较宽,振子强度较大,可以作为潜在的化学发光材料用于生物成像研究.

基于萤火虫烯醇式氧化荧光素的一系列衍生物的结构和光学性质

通过密度泛函理论(DFT)MPW3PBE泛函,对甲基、甲氧基、氰基、氟原子、氨基、硝基取代的萤火虫生物发光底物烯醇式氧化荧光素进行了全优化。计算了他们的电离能(IP)、电子亲和势(EA)、空穴抽取能(HEP)、电子抽取能(EEP)、空穴和电子重组能(λ),评估了它们的空穴和电子传输能力。用含时密度泛函理论(TDDFT)MPW3PBE/6-31+G(d)方法计算了吸收光谱,优化了最低单重态S1,最终研究了它们的荧光光谱。理论计算结果表明,E-CN是具有双重功能的OLEDs材料的优良候选者,即可同时作为电子传输层和发光层材料。E-NO2、E-F和E-OCH3可以作为电子传输材料。而E-NH2可作为空穴传输材料。

荧光素酶研究进展

荧光素酶 (Luciferase)可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。萤火虫荧光素酶是分子量为 60～ 64kD的多肽链 ,在Mg2 +、ATP、O2 存在时 ,催化D 荧光素 (D Luciferin)氧化脱羧 ,发出光 (λ =5 5 0～ 5 80nm)。细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的加单氧酶 ,它催化长链脂肪醛、FMNH2 和O2 的氧化反应 ,发出绿蓝光 (λ =490nm)。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶可分别从萤火虫和发光细菌中直接提前 ,亦可用基因工程的方法进行生产。荧光素酶催化的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测 ,因此该酶有多方面的用途 ,如应用于快速检测、报告基因分析。

含荧光素酶四膜虫B2086-LUC全细胞生物传感器的构建及其对重金属离子的响应

为了获得可用于快速检测环境中重金属污染的全细胞生物传感器,本研究将含有HA标签的萤火虫荧光素酶(LUC)基因重组到含有四膜虫金属硫蛋白MTT1启动子和微管蛋白终止子序列的载体pBX中,获得重组质粒pBX-LUC,用基因枪粒子轰击法将pBX-LUC转化入四膜虫细胞中,通过同源重组和巴龙霉素抗性筛选,LUC基因整合到四膜虫大核基因组MTT1位点,获得含有LUC基因的细胞株B2086-LUC.B2086-LUC对重金属镉和汞的响应敏感,可检测的最低浓度为5-10ng/mL;对铜和锌的响应较弱,可检测的最低浓度为0.5-1mg/mL.因此,四膜虫B2086-LUC可作为环境中镉和汞污染快速检测的全细胞生物传感器.

中华黄萤荧光素酶的性质

近年来,萤火虫荧光素酶催化的生物发光反应被广泛的应用到ATP检测、细菌数目检测、环境监测和其他生物学研究之中。通过对中华黄萤荧光素酶的性质研究,发现其分子量为6 400左右,是一种非典型的Michaelis-Menten氏酶,对底物之一的ATP动力学曲线为S型。最适反应温度为20～25℃,对温度极其敏感,当反应温度高于30℃时,该酶的活性快速失活。该荧光素酶的最适pH=6.5。随着pH值的下降该荧光素酶生物发光的最大发射光波长没有明显的红移现象。Mg^(2+)和Mn^(2+)对该酶活性的激活效果比较接近,最佳的激活浓度均在1mmol/L附近,而Ca^(2+)最佳的激活浓度则小于1 mmol/L,且激活的效果只有Mg^(2+)作用效果的50%左右。和Hg^(2+)、Cd^(2+)等离子一样,Cu^(2+)会在一定程度上抑制该荧光素酶的活性。该酶的稳定性较差,对盐浓度和光照比较敏感,高浓度的盐类和长时间的日光照射能够使酶失活。谷胱甘肽(GSH)和二硫苏糖醇(DTT)是该酶较好的保护剂,可以提高该酶在一定时间内的稳定性,其中前者的作用效果要好于后者。

双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展

双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中,一个报告基因活性的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而另个报告基因的组成型活性则提供内对照,使实验值正态化。目前很多实验都采用了荧光素酶报告基因(Luc),但从检测速度、灵敏度和线性范围来考虑,双荧光素酶即萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的组合,可以较好地体现检测结果的精确性。本文以萤火虫双荧光素酶报告基因系统为重点,综述了该报告系统的特点、应用和近年来的研究进展。

荧光素酶编码基因luc在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

以荧光虫荧光素酶报告载体pXP2 DNA为模板,扩增得到编码萤火虫荧光素酶(LUC)的基因(luc),构建了诱导型表达载体pQE30-luc。将载体导入E.coliM15获得高效诱导表达萤火虫荧光素酶基因的重组菌M15/pQE30-luc。SDS-PAGE电泳分析显示:重组蛋白的相对分子质量为60 000,表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的50.9%.利用表达载体pQE30上的His.Tag标记选用Ni柱纯化表达具有活性的萤火虫荧光素酶(LUC),纯化后比酶活达到1.43×109RFU/mg,纯化倍数达10.6倍,回收率为25.3%.