苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对营养期杀虫蛋白Vip3A杀虫毒力的影响

为检测苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20和cyt1A基因与vip3A基因连接构建了重组质粒pHVC20,然后电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株CryB中进行了共表达,以单独表达Vip3A蛋白的CryB(pHPT3)作为对照菌株。Westernblot结果显示,Vip3A蛋白在CryB(pHVC20)菌株中的最大表达量约为在CryB(pHPT3)菌株的2倍,这可能是由于前者中的辅助蛋白P20增加了Vip3A表达量的缘故,晶体蛋白Cyt1A的存在对Vip3A的正常表达没有影响。生物测定结果表明,CryB(pHVC20)和CryB(pHPT3)菌株对斜纹夜蛾初孵幼虫的LC50值分别为10.62!g/ml和78!g/ml,前者的毒力比后者提高了6倍,这表明Cyt1A蛋白和Vip3A蛋白对目标昆虫的毒力可能存在着协同增效作用。

苏云金杆菌辅助蛋白P20对营养期杀虫蛋白Vip3A表达的影响

为检测苏云金杆菌辅助蛋白P20对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20基因与vip3A基因相连构建了重组质粒pHVP20,然后电激转化至Bt中进行了共表达,以仅携带vip3A基因的质粒pHPT3作为对照质粒。Westernblot结果显示,当vip3A基因和p20基因在Bt无晶体缺陷株CryB中共表达时,Vip3A蛋白的最大表达量约是其在CryB(pHPT3)菌株中单独表达的1.5倍。生物测定结果表明,CryB(pHVP20)和CryB(pHPT3)菌株对初孵斜纹夜蛾幼虫的LC50值分别为48.79μg/mL和78.00μg/mL,这说明P20蛋白可以促进vip3A基因在Bt中的表达,但对提高Vip3A蛋白的杀虫毒力没有显著性帮助。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A研究进展

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,VIP)Vip3A是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thurigiensis,Bt)在营养生长对数中期开始分泌的一类杀虫蛋白,其广泛存在于Bt菌中,现已发现8类37种,在遗传上比较保守。与杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)相比,Vip3A蛋白具有热不稳定性,其杀虫机理与ICPs也不同,并且Vip3A蛋白与不同Bt杀虫晶体蛋白具有协同增效作用,这为筛选新的杀虫基因、构建特异高毒力工程菌和转基因抗虫植物以及杀虫分子机理等基础研究提供了新的思路。

苏云金芽孢杆菌新型营养期杀虫蛋白Vip3A研究

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,Vip)Vip3A是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长对数中期分泌产生的一类新型杀虫蛋白。Vip3A广泛存在于Bt中,与晶体杀虫蛋白(InsecticidalCrystal Proteins,ICPs)没有任何同源性,不具有多样性,在遗传上比较保守。其N-端存在一趋化信号传导因子相似序列,C-端存在着纤维素结合结构域。Vip3A蛋白通过诱发细胞凋亡,最终导致细胞死亡,这与Btδ-内毒素的作用机理完全不同。本文主要对Vip3A杀虫蛋白的发现、特性及作用机理作一简要综述。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5，对218株Bt菌株进行PCR鉴定，有51株含有vip3A类基因，其中12株为不同亚种的标准菌株，有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因，并插入表达载体pET—21b，转化大肠杆菌BL21，诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白，表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性，LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg，对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列)，杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低，说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3研究进展

营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein,VIP)是由苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为VIP1、VIP2和VIP3三种,以VIP3的研究最为深入。VIP3A对鳞翅目害虫具广谱杀虫活性,可作用于敏感昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊致离子通道的形成,杀虫活性达纳克级水平。利用BtICPs不同启动子与vip3基因重组可提高VIP3蛋白的表达量和稳定性。转vip3基因植物也已有构建成功的报道。本文从VIP3的类型和杀虫活性、作用机理、vip3基因的定位和分离、vip3基因重组和转vip3基因植物等方面详细介绍了VIP3近十年来的研究进展。

苏云金杆菌营养期蛋白杀虫活性及Vip3A-LS1基因克隆

对营养期高活性杀虫菌株进行筛选,得到高效菌株BtLS1,对其营养期杀虫蛋白活性及发酵特性进行了系统研究,克隆了该菌株的vip3A新基因。测定了31株vip3A基因阳性菌株营养期杀虫蛋白的活性,发现BtLS1和BtLS8菌株对甜菜夜蛾Spodopteraexigua生长的抑制作用明显高于其他菌株。进一步研究表明,BtLS1菌株营养期杀虫蛋白对初孵和2龄甜菜夜蛾幼虫的体重增长抑制率分别为95.3%±2.1%和90.7%±6.6%;对棉铃虫Helicoverpaarmigera初孵幼虫的校正死亡率为22.1%,对2龄幼虫的体重增长抑制率为78.7%±6.6%。发酵液中以胞内可溶性物质为主。设计vip3A全长基因特异引物PCR扩增,插入质粒pBluescriptSK(+),克隆测序证实该菌株中存在vip3A新基因,命名为Vip3A-LS1,GenBank登录号为DQ016968。按该序列推断的蛋白与同类蛋白的8个氨基酸之间存在差异。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白。为了探讨苏云金芽胞杆菌B.thuringiensis营养期杀虫蛋白基因(vip3A)在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株。SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达。生物测定表明有5株168的工程菌株(168vip1-4,6)表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液(约107CFU/mL)处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72h的杀虫效果可达87.64%～92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用。毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72h的LC50为0.0194mL/mL。这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础。

Bacillus thuringiensis营养期杀虫蛋白Vip3与其转基因植物研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中,最主要的是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)和营养期杀虫蛋白(Vegetative insectici-dal protein,Vip)。当前,大部分商业化利用的转基因作物均为杀虫晶体蛋白类,随着这些转基因作物种植面积的扩大,害虫对这些较为单一的杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。Vip3是Vip杀虫蛋白中的一类,不形成蛋白晶体,和ICPs在进化上没有同源性;其对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等害虫具有毒杀作用,抗虫谱较广。目前,已经把Vip3基因导入了水稻、玉米和棉花等多种作物中,为作物抗虫育种、延缓害虫产生抗性和减少作物产量损失等带来新的前景。

Bt营养期杀虫蛋白Vip3及其作用受体的研究进展

营养期杀虫蛋白Vip3是苏云金芽胞杆菌在对数生长中期开始分泌表达的一类对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的蛋白质,它与已知的杀虫晶体蛋白相似性很低。本文主要从vip3基因的挖掘,Vip3蛋白的特性、作用受体及其应用等方面作简要综述。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3的研究进展

为了更好地理解Vip3毒素的研究进展,从Vip3毒素的类型、理化特性、功能、杀虫机理以及应用研究等方面做了详细的综述。并指出,尽管Vip3毒素的研究取得了很大的进展,但是还有一些重要的问题在后续研究中亟待解决。

苏云金芽孢杆菌新型营养期杀虫蛋白Vip3研究进展

营养期杀虫蛋白是由苏云金芽孢杆菌在营养生长对数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫蛋白。Vip根据蛋白质序列同源性主要分为三类:Vip1、Vip2和Vip3,以Vip3的研究最为深入,Vip3对鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性。本文就Vip3的类型和杀虫活性、作用机理、基因的定位和分离、基因重组和转Vip3基因植物等方面详细介绍Vip3近十年来的研究进展。

营养期杀虫蛋白Vip3类转基因抗虫作物的研发进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的营养期杀虫蛋白Vip3是由5个结构域组成的四聚体,其N-端主要控制结构的稳定,C-端为潜在的特异性受体结合域,共有14个模式样本,超过110种蛋白。与晶体蛋白(crystal proteins, Cry蛋白)一样,Vip3经蛋白酶消化后的杀虫活性物质主要作用于昆虫的中肠组织,可通过与特异性受体的结合引起肠道穿孔或细胞溶解,从而导致昆虫死亡。由于Vip3与Cry蛋白具有不同的杀虫机制和很强的杀虫谱互补性,国内外多采取这2类基因叠加的策略来研发新型转基因抗虫作物。Vip3Aa转基因玉米和棉花已经在美国和巴西等国家商业化种植,成为治理草地贪夜蛾等靶标害虫对Cry蛋白产生抗性的主要手段。实验室的选择压汰选表明,多种靶标害虫也可对Vip3产生较高的抗性,田间监测已证实其抗性的存在。因此,对靶标害虫的抗性监测与治理对Vip3类转基因抗虫作物产业化具有重要意义。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用

将构建的营养期杀虫蛋白基因vip83表达质粒pBMB2 32 8和含杀虫晶体蛋白基因(cry1Ac1 0或cry1Ca)质粒同时电转化无质粒突变株BMB1 71并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证 ,分别得到含cry1Ac1 0和vip83、cry1Ca和vip83的双基因重组菌BMB2 830 1 71和BMB2 882 1 71。用单基因重组菌作对照 ,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白Cry1Ac1 0和Cry1Ca两组蛋白对 3种重要鳞翅目害虫毒力。经统计分析 ,结果表明两组杀虫蛋白Vip83与Cry1Ac1 0和Vip83与Cry1Ca之间对棉铃虫均存在拮抗作用 ,对甜菜夜蛾协同作用不明显 ;但对小菜蛾前者协同作用不明显 ,而后者则有增效作用 ,其共毒系数为32 6。双基因的遗传稳定性检测表明这种正负协同关系具有一定的分子遗传稳定性 。

营养期杀虫蛋白VIPs研究进展

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins,VIPs)是苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒蛋白。本文简述了芽孢杆菌属(Bacillus)中的新型活性杀虫蛋白营养期杀虫蛋白VIPs及其编码基因的发现、特性、作用模式等研究进展。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vips研究进展

苏云金芽孢杆菌Bt营养期杀虫蛋白Vips主要分为Vip1、Vip2和Vip33种。Vip1和Vip2构成二元毒素,对叶甲科昆虫具有特异杀虫活性。Vip3对鳞翅目昆虫具有广谱杀虫活性,该蛋白广泛存在于Bt中,与已知杀虫晶体蛋白ICPs没有序列相似性。Vip3通过诱发细胞凋亡,最终导致昆虫死亡,这与Btδ-内毒素的作用机理完全不同,Vips的发现对于Bt的进一步开发利用具有重要意义。本文主要对营养期杀虫蛋白Vips的分布、特性、作用机制及应用等进行报道。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp .Leesis)菌株YBT 833、鲇泽亚种 (subsp .Aizawai)菌株YBT 1416和库斯塔克亚种 (subsp .Kurstaki)菌株YBT 15 35为出发菌株 ,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针 ,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示 3株菌株的营养期杀虫蛋白基因 ,均位于经XbaI完全消化的 4～ 5kb大小的DNA片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体 ,建立了 3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到 3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15 ,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在 5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌 大肠杆菌穿梭载体pHT315 ,分别得到重组质粒pBMB890 1和pBMB890 2。将它们电转化到vip- 的B .t.受体菌BMB171和 4Q7,获得了相应的工程菌BMB890 1 171,BMB890 2 171,BMB890 1 4Q7和BMB890 2 4Q7。SDS PAGE电泳检测均有 88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了 ,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性 ;其中对小菜蛾的毒力最高 ,LC50 值分别为 2 8.6 ,31.6 ,45 .4和 37.6 μL mL。该结?

苏云金杆菌营养期杀虫蛋白的研究

营养期杀虫蛋白 (vegetativeinsecticidalproteins ,VIPs)是苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒蛋白。VIPs主要分为VIP1、VIP2和VIP3三种。VIP1和VIP2构成二元毒素 ,对鞘翅目叶甲科的昆虫具有杀虫特异性 ;而VIP3对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性。VIP1和VIP2的杀虫作用机理还不清楚 ;VIP3通过诱发细胞凋亡 ,最终导致昆虫死亡 ,这种作用机理与Bt杀虫晶体蛋白的作用机理完全不同 ,这为筛选新的杀虫活性物质提供了新的思路。vip基因现已被应用于转基因杀虫植物的构建 ,得到高效抗虫的多价转基因玉米。此外 ,VIPs嵌合蛋白的构建、vip及其融合基因导入其它许多宿主微生物等方面的研究也具有诱人的潜在应用前景。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因特性分析

营养期杀虫蛋白是在苏云金芽胞杆菌营养期中发现的一种非晶体状胞外杀虫蛋白 .通过Southern杂交的基因定位实验 ,证实了营养期杀虫蛋白基因并非位于染色体和环型质粒上 ;在 2 0个不同血清型的 2 3种菌株中 ,营养期杀虫蛋白基因的存在率为 5 6 5 % (13 2 3) .同时对随机选择的 3个不同亚种菌株进行基因克隆和序列分析 ,表明其基因具有相当高的同源性 .运用生物信息技术 ,对营养期杀虫蛋白多肽进行了功能结构域比对分析 ,发现这 789多肽蛋白的N端 31至 15 0残基之间存在一种趋化信号传导因子相似序列 ,C端 5 36至 6 6 6残基之间则存在着纤维素结合结构域相似肽 .上述结果提示 ,营养期杀虫蛋白基因在苏云金芽胞杆菌天然菌株中高度保守并较为广泛分布 ,其编码蛋白的特殊结构提示了营养期杀虫蛋白潜在的功能特性 ,为进一步研究营养期杀虫蛋白奠定了基础 .