萼脊兰AP1-like基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从萼脊兰(Sedirea japonica)花瓣中分离到1个MADS-box A类基因,该基因命名为AP1-like(登录号JQ776636)。AP1-like基因的cDNA全长1 221bp,包含1个753bp的开放阅读框(ORF),共编码250个氨基酸。蛋白序列比对和进化树分析表明,AP1-like蛋白与蝴蝶兰ORAP11蛋白的一致性为96%,进化距离最近。二级结构分析表明,该蛋白分子属于亲水性蛋白,其中有53.60%的α螺旋、7.20%的延伸链、39.20%的不规则折叠。实时荧光定量PCR分析表明,萼脊兰AP1-like基因在盛花期的根和叶中表达量最高;在生殖器官中花蕾期花葶的表达量最高,其次是花蕾;盛花期中花葶的表达量最高,子房和合蕊柱的表达量次之,萼片、花瓣、唇瓣均有微量表达。研究认为,AP1-like可能在调控植物由营养生长向生殖生长过渡阶段及子房的建成中起重要作用。

萼脊兰MADS-box基因的克隆及表达载体构建

为了研究"ABC"模型的B类PI基因,探究决定花瓣和雄蕊形成的基因特征。采用CTAB法提取萼脊兰花瓣总RNA,并通过RT-PCR法克隆萼脊兰PI基因的编码序列,该序列长度为633 bp,编码210个氨基酸,与小兰屿蝴蝶兰的氨基酸相似性最高。对PI所表达蛋白质的结构、亲水性和二级结构进行了分析,结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守结构域,属于MADS-box基因家族;该蛋白分子属于亲水性蛋白,包含56.19%α螺旋、13.81%的延伸链以及30%的不规则折叠,实时荧光定量PCR结果显示,PI基因主要在花器官中表达,且表达量高,说明PI基因的表达具有组织特异性。构建植物表达载体的结果显示,目的基因和带启动子的片段已插入到表达载体p CAMBIA1301中,表明成功构建植物表达载体1301-PI,为最终获得新奇花型的萼脊兰奠定基础。

萼脊兰SeAP1-like基因的克隆与表达载体构建

根据NCBI网站上萼脊兰AP1-like全长基因序列设计引物,采用RT-PCR法从萼脊兰花瓣中扩增Se AP1-like基因,对扩增产物进行克隆和测序。结果表明,获得的萼脊兰Se AP1-like基因为743 bp,编码247个氨基酸。将Se AP1-like基因插入p CAMBIA1304载体中,经PCR、双酶切鉴定,证实重组表达质粒中含有目的片段,表明成功构建了高效植物表达载体p CAMBIA1304-Se AP1。对Se AP1-like基因的结构域和所表达蛋白质的亲水性进行了分析,并预测了该基因所表达蛋白的二维结构。结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守域,属于MADS-box基因家族,该蛋白分子属于亲水性蛋白。二级结构分析表明,其包含57.49%的α螺旋、6.07%的延伸链、36.44%的不规则折叠。

萼脊兰Actin基因片段的克隆及序列分析

从萼脊兰叶片中克隆Actin基因,为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础。根据GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物,以萼脊兰叶片总RNA为模板,利用RT-PCR技术得到了3个Actin基因片段。序列分析结果表明,3个Actin基因片段长度均为1062bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列的同源性在80%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为SeACT1、SeACT2和SeACT3,并在GenBank注册,登录号分别为JN981138、JN981139和JN981140。

萼脊兰EF1α基因片段的克隆及序列分析

为探明萼脊兰EF1α基因在生长发育过程中的生理功能和作为内参基因的稳定性及适用性,根据NCBI中植物翻译延长因子同源核苷酸保守序列设计简并引物,以萼脊兰叶片为试验材料,采用RNAprep多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA,利用RT-PCR技术克隆翻译延伸因子EF1α,并进行生物信息学分析。结果表明:EF1α基因长620bp,编码206个氨基酸,编码的蛋白为亲水性蛋白,相对分子质量为23.16KD,等电点为8.50;经二级结构分析,α-螺旋占29.61%,延伸链占31.55%,无规则卷曲占38.83%;亚细胞定位在细胞质;EF1α基因与朵丽蝶兰杂交品种翻译延伸因子蛋白的一致性较高,进化距离最近。在GenBank登录号为KT223116。

萼脊兰AGAMOUS(AG)基因的克隆与表达分析

通过对萼脊兰AGAMOUS(AG)基因进行结构、功能分析、克隆和AG基因的表达调控等方面的探究,发现,萼脊兰AG的氨基酸序列属于植物特有的MIKC型MADS-box的C类基因,该基因c DNA全长1 002 bp,包含一个702 bp的开放阅读框,该基因命名为AG(登录号KY744276),共编码233个氨基酸。蛋白序列比对和进化树分析表明,AG蛋白与蝴蝶兰蛋白一致性最高,进化距离最近。二级结构分析表明,该蛋白分子属于亲水性蛋白,其中α螺旋占48.93%,延伸链占11.59%,不规则卷曲占39.48%。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,AG基因在花蕾和蕊柱中表达量很高,说明AG基因的表达具有组织特异性,在ABCDE模型中属于C类基因的特征非常明显,控制着雄蕊和雌蕊的发育。

萼脊兰光合特性的初步研究

以萼脊兰为材料,利用Li-6400光合测定系统对其叶片的光合特性进行了研究。结果表明：萼脊兰的CO2交换方式具景天酸代谢途径（CAM）的特点,叶片净CO2吸收速率在凌晨0：00左右达到最大值,可滴定酸的积累在8：00左右达到顶峰。在晴天的上午,萼脊兰的最适光照强度为400～600μmol/（m2·s）,其叶片的净CO2吸收速率达到2.92μmol/（m2·s）。在最适光强条件下,温度在25℃,CO2浓度为800～1 000μmol/mol时,最利于萼脊兰叶片净CO2的吸收。总的来说,萼脊兰属兼性CAM兰花,这种光合特性体现了其作为一种热带兰花对生长环境的高度适应性。

萼脊兰胚培养与快速繁殖研究

[目的]研究萼脊兰的组织培养和快速繁殖技术。[方法]以萼脊兰的胚为材料,进行无菌胚培养,筛选适宜的培养基和适宜浓度的添加物。[结果]萼脊兰胚的萌发以1/4 MS最适宜,培养80 d时萌发率高达70%以上,其次为1/8 MS1、/2 MS。不同激素种类和不同浓度激素对胚萌发的影响比较大,以浓度0.5 mg/L KT的效果最佳。有机添加物对萼脊兰胚的萌发有明显的影响,效果以10%椰子水最好。培养基中添加活性炭,对胚的萌发具有显著的促进作用。[结论]该研究建立起一套杂交兰快速繁殖及成苗的途径,可为以后的生产研究奠定理论基础。

萼脊兰ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义基因表达载体的构建

根据已报道的几种不同属的兰科植物ACO基因序列,设计并合成了一对特异引物,以萼脊兰的基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出萼脊兰ACO基因的部分片段,将其连接到pMD19-T质粒载体上进行测序。结果显示,该片段的长度为333bp,序列和蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrid)、卡特兰(Cattleya intermedia)、两棱蕾丽兰(Laelia anceps)的相应ACO片段的同源性分别达到达到99.7%、92.49%和92.19%;和大花蕙兰(Cymbidium hybrid)、石斛兰(Dendrobium crumenatum)的同源性分别是89.49%和89.19%。将此片段反向插入植物表达载体pBI221的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,成功构建了萼脊兰ACO的反义基因植物表达载体pBI-antiACO。

萼脊兰SjHMGR基因克隆及表达分析

为探究兰科植物的花香基因,拓展兰科植物在花香分子育种方面思路。以萼脊兰花瓣为实验材料,按照NCBI上登录的兰科植物的HMGR基因序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术成功克隆萼脊兰3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(SjHMGR)。采用生物信息学方法,利用内参基因EF1a,对SjHMGR基因的时空表达特性进行分析研究。结果显示,获得的SjHMGR基因全长为1892 bp,开放阅读框为1689 bp,编码367个氨基酸,登录号为MK448292;SjHMGR有3个HMG-COA特殊位点,且属于HMG-COA超基因家族;SjHMGR编码的蛋白为亲水性蛋白;亚细胞定位于线粒体;蛋白质2级结构分析发现,SjHMGR蛋白具有α-螺旋、延伸链和不规则折叠。SjHMGR编码蛋白质的功能预测发现,SjHMGR在中间代谢起到非常重要的角色;同源性分析与系统进化树分析发现,萼脊兰SjHMGR蛋白与兰科的进化距离最近,在同1个分支上。qRT-PCR结果显示,SjHMGR基因在根和叶中的表达量很低,在萼片和花瓣中的表达较高,具有时空特异性。

蝴蝶兰与萼脊兰光合特性的比较

以蝴蝶兰和萼脊兰为材料,对其叶片的CO_2吸收速率、可滴定酸含量和叶绿素荧光参数的昼夜变化进行研究。结果表明:蝴蝶兰和萼脊兰的CO_2交换方式都具景天酸代谢途径(CAM)的特点,其叶片的净CO_2吸收速率分别在22:00和凌晨0:00左右达到最大值。蝴蝶兰暗适应下的叶绿素荧光参数最小荧光F_o、最大荧光F_m、最大可变荧光F_v、可变荧光产量与最大荧光产量之比F_v/F_m、光系统Ⅱ潜在活性F_v/F_o均高于萼脊兰。蝴蝶兰和萼脊兰叶绿素荧光参数日动态变化结果表明,蝴蝶兰所需要的光照强度显著低于萼脊兰,太高的光强将引起植株的光抑制,从而引起光化学效率的下降。总的来说,蝴蝶兰为专性CAM兰花,萼脊兰属兼性CAM兰花,在蝴蝶兰与萼脊兰杂交后代的栽培中,在避免过高的光强引起其光抑制的同时,可提供特定的环境条件以诱导其叶片更多地进行C_3途径光合,尽量减少CAM途径光合,从而有效地促进其干物质的积累,促进杂交后代的生长。

萼脊兰总RNA提取方法的比较研究

采用Trizol法、CTAB法、RNA prep Pure Plant Kit方法分别从萼脊兰的根、叶、花葶、花萼、花瓣、唇瓣、柱头中提取总RNA,比较3种总RNA提取方法的优劣,分析所提取萼脊兰不同组织总RNA质量高低。结果显示:CTAB法提取的RNA得率最高,完整性好,凝胶电泳泳道无杂质,条带单一,可以满足荧光定量PCR的试验需要。

萼脊兰TUB基因片段的克隆及序列分析

为了给筛选萼脊兰内参基因和研究 TUB 基因的生理功能提供研究基础，对萼脊兰 TUB 基因片段进行克隆与序列分析。采用 CTAB 法提取萼脊兰盛花期花瓣总 RNA，并运用 RT-PCR 方法克隆萼脊兰 TUB 基因序列，长度为1055 bp，编码351个氨基酸残基，氨基酸序列中存在微管蛋白的保守区域 GGGTGSG。序列分析结果表明：与其他已登录物种的 TUB 基因相比，其核苷酸序列的同源性达75％～96％，与朵丽蝶兰（JN185665．1）同源性高达96％，氨基酸序列的同源性也在96％以上，且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性。在 GenBank 注册，登录号为KP686397。

调控萼脊兰类黄酮生物合成的MYB转录因子挖掘分析

本研究通过生物信息学方法,挖掘萼脊兰中可能调控类黄酮生物合成的MYB转录因子。从萼脊兰转录组数据库中筛选MYB转录因子,获得MYB的完整ORF,并对其蛋白理化性质、基序、功能注释、系统进化、表达特性等进行分析,并预测其功能。结果表明:在萼脊兰转录组水平上共鉴定出27个具有完整阅读框的MYB转录因子基因,萼脊兰MYB转录因子TRINITY_DN38485_c0_g4和TRINITY_DN38485_c0_g1基因均在花朵和叶片中表达上调,再根据与蝴蝶兰的系统进化关系与功能分析,预测这2个转录因子可能通过黄酮途径完成类黄酮生物合成。因此,MYB转录因子的研究对从分子水平上研究和调节类黄酮的合成具有重要意义,转录因子的应用是类黄酮生物合成基因工程中的新途径。

短茎萼脊兰种质特性研究

在浙江省境内采集到短茎萼脊兰种野生植株,并对其野生生境、植物学特性与开花结果习性进行了观察研究;通过耐寒性试验、测评,发现在室内绝对低温6.1℃条件下,短茎萼脊兰能安全越冬,用电导法配合Logistic方程分析,其低温半致死温度为1.7℃;根据杂交试验结果,短茎萼脊兰与蝴蝶兰间具有较强的亲和力,杂交组合坐果率达37.5%～81.25%。

短茎萼脊兰生境与特性初步研究

在浙江省境内采集到短茎萼脊兰野生植株,并对其野生生境、野生状态植物学特性与生物学习性进行初步研究;通过用电导法配合Logistic方程分析,与蝴蝶兰栽培品种wr054低温半致死温度进行比较,发现短茎萼脊兰低温半致死温度为1.7℃。

萼脊蝴蝶兰开花特性与繁育系统研究

【目的】研究萼脊蝴蝶兰Phalaenopsis japonica的开花特性与繁育特性,为萼脊蝴蝶兰杂交育种提供理论依据,也为濒危蝴蝶兰属Phalaenopsis植物种质资源保护提供研究基础。【方法】以温室条件下栽培的萼脊蝴蝶兰为材料,记录其花器官特性和开花进程,测定花粉活力与柱头可授性,分析花粉组织化学,估算杂交指数并进行人工控制授粉试验。【结果】①萼脊蝴蝶兰群体花期4月中旬至5月底,单株花期30~40 d,单花花期约30 d,开放时有香味。花蕾期为开花前1~7 d,初花期为开花后1~5 d,盛花期为开花后6~25 d,末花期为开花后26~30 d,凋谢期为开花后30~40 d。②总状花序,单株花序多为1~2个,单花序约10朵花。③萼脊蝴蝶兰花粉为近圆形四合花粉,主要由脂质组成,适合虫媒授粉。④雌雄同株,且同步成熟,在盛花期(开花6~25 d)花粉活力与柱头可授性均达到最强,花粉活力高达84.98%,杂交指数为4。⑤自然授粉、自然自花授粉、去雄不授粉3种处理后的结实率均为0,而人工自花授粉、人工同株异花授粉和人工异株授粉的结实率高达60.00%、80.00%和93.33%,且人工异株授粉果实质量最好,种子最大,种子活力最高(82.69%),单果实中种子数量约43000粒。【结论】萼脊蝴蝶兰开花始于4月中旬,结束于5月底,盛花期持续约20 d,其繁育系统属于兼性异交,需要传粉者的类型。

萼脊兰FPPS基因的克隆及表达分析

为了深入研究兰科植物花香的调控机制,该研究以萼脊兰为材料,利用RACE技术克隆萼脊兰花香物质的关键酶基因FPPS的全长序列并对其进行生物信息学分析和时空表达分析。结果显示:FPPS基因全长为1317bp,开放阅读框(ORF)长度为1047bp,编码348个氨基酸(GenBank登录号为MG018616)。FPPS编码的蛋白质为亲水性蛋白,等电点(pI)为5.11。萼脊兰FPPS氨基酸序列与春兰的相似性为92%,与霍山石斛的相似性为90%。FPPS蛋白分布于线粒体、叶绿体和分泌途径中,且可信度为3。预测FPPS蛋白质结构功能,可能有意义的功能包括翻译、氨基酸的生物合成、脂肪酸代谢和辅酶因子的生物合成等,他们的几率分别是4.666、4.108、3.689、3.040;对其蛋白质二级结构进行预测,α螺旋占39.37%,无规则卷曲占43.10%,延伸链占17.53%;以4kk2.1.A为模板进行蛋白质的三维结构预测,与FPPS蛋白一致性为72.14%。荧光实时定量PCR结果显示,FPPS基因在盛花期的花瓣中表达量最高,时空特异性明显,为研究萼脊兰花香成分和花香分子生物学打下了良好基础。

国家重点保护野生植物介绍——蝴蝶兰属

蝴蝶兰属(Phalaenopsis)是兰科中最具园艺价值的类群,蝴蝶兰因其色彩艳丽,外形酷似蝴蝶而得名,已培育出很多观赏品种,成为极受人们喜爱的兰花,被誉为“兰花皇后”。基于分子证据的蝴蝶兰属植物研究进展,蝴蝶兰属归并了羽唇兰属。袋距兰属、象鼻兰属、萼脊兰属、湿唇兰属、五唇兰属等属,合并后的蝴蝶兰属全世界共有70种野生种,中国分布有18种。