啤酒花中异葎草酮体外抗肿瘤作用及机制研究

研究啤酒花(Humulus Lupulus L.)中成分异葎草酮(tetrahydro-iso-α-acid)对人胃腺癌细胞SGC-7901和人肝癌细胞HepG-2的体外抑制作用,并初步揭示其抗肿瘤的作用机制.以MTT法进行细胞毒测定;采用流式细胞仪观察异葎草酮对肿瘤细胞凋亡的影响;细胞线粒体跨膜电位(MMP)测定用罗丹明123(Rhodamine l23,Rh123)标记,以流式细胞仪检测.异葎草酮对SGC-7901和HepG-2的IC50分别为13.4μg/mL和11.58μg/mL.异葎草酮作用于SGC-7901和HepG-2细胞48 h后,肿瘤细胞均有明显凋亡峰出现.异葎草酮可以导致SGC-7901和HepG-2细胞内线粒体膜电位明显下降,并呈剂量依赖关系.结果表明,异葎草酮对肿瘤细胞SGC-7901及HepG-2均有较强抑制作用,这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的.异葎草酮是通过线粒体路径启动细胞凋亡的,而且诱导线粒体功能异常可能是其引起细胞凋亡发生的主要作用机理.

四氢异葎草酮诱导SGC-7901细胞凋亡作用的研究

观察四氢异葎草酮(Tetrahydro-isohumulone,TH)通过线粒体途径诱导SGC-7901细胞凋亡的机制.MTT法检测TH对SGC-7901细胞增殖的影响;荧光显微镜观察TH对SGC-7901细胞凋亡形态的影响;流式细胞仪分析SGC-7901细胞凋亡率;采用试剂盒检测Caspase-9的活性;Western blot法检测Caspase-3蛋白表达情况.2、8、32μg/mL的TH处理SGC-7901细胞72 h后,SGC-7901细胞生长受到抑制,抑制率在一定范围内呈剂量、时间相关性;随着TH质量浓度的提高SGC-7901细胞的凋亡率也增加;TH各剂量均能够显著升高SGC-7901细胞内Caspase-9活性,并呈剂量依赖性;同时,TH能够上调SGC-7901细胞内Caspase-3的表达量,并且呈剂量依赖性.TH可通过诱导SGC-7901细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,启动线粒体凋亡通路可能是TH诱导SGC-7901细胞凋亡的重要机制之一.

啤酒花中四氢异葎草酮诱导HepG-2细胞凋亡的机制研究

目的:研究啤酒花(Humulus Lupulus L.)中成分四氢异葎草酮(Tetrahydro-isohumulone)对肿瘤细胞HepG-2生长抑制及诱导凋亡的作用。方法:MTT 法检测四氢异葎草酮对 HepG-2细胞体外增殖抑制的影响;流式细胞仪分析四氢异葎草酮对 HepG-2细胞的凋亡率、线粒体膜电位和活性氧生成;激光共聚焦显微镜测定细胞内[Ca^(2+)]i。结果:四氢异葎草酮对 HepG-2的增殖具有较强的生长抑制作用,IC_(50)为6.76μg/mL.0,5、10、20μg/mL 剂量的四氢异葎草酮作用 HepG-2细胞48h 细胞凋亡率分别为0.1%、24.1%,69.9%、84.1%,同时线粒体膜电位降低,细胞内活性氧含量升高,细胞内[Ca^(2+)]i 随给药剂量增加而升高。结论:四氢异葎草酮对 HepG-2具有较强的生长抑制作用,并且能够诱导 HepG-2细胞凋亡,其机制可能是通过升高细胞内 Ca^(2+)浓度使线粒体膜通透性增加,进而导致细胞凋亡。

苦味酸类成分蛇麻酮和葎草酮对大鼠成骨细胞和破骨细胞的干预作用

目的研究苦味酸类成分蛇麻酮和葎草酮对大鼠成骨细胞及破骨细胞活性的干预作用。方法以新生24 h的Wistar大鼠所分离的成骨细胞和破骨细胞为研究对象,设置对照组,蛇麻酮处理低(10-15mol/L)、中(10-14 mol/L)、高(10-13 mol/L)剂量组,以及葎草酮处理低(10-15 mol/L)、中(10-14 mol/L)、高(10-13 mol/L)剂量组。药物处理后,分别用MTT法、碱性磷酸酶(ALP)活性检测以及茜素红染色法评价蛇麻酮和葎草酮对成骨细胞增殖、分化及骨矿化水平的影响。采用破骨细胞计数以及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性检测评价蛇麻酮和葎草酮对破骨细胞活性的影响。采用试剂盒法检测骨钙素(OCN)水平,采用蛋白质印迹法检测骨形成相关蛋白骨桥蛋白(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、骨形成蛋白(BMP-2)以及骨吸收相关蛋白组织蛋白酶K(CK)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达,评价蛇麻酮和葎草酮在骨代谢调控方面的作用。结果在大鼠成骨细胞水平上,与对照组相比,蛇麻酮在10-15、10-14 mol/L浓度下可促进成骨细胞增殖(P<0.05),在10-14、10-13 mol/L浓度下可提高ALP活性以及骨矿化水平(P<0.05,P<0.01),在10-13 mol/L浓度下可促进OCN的表达(P<0.01),在10-14、10-13 mol/L浓度下可提高骨形成相关蛋白BSP和BMP-2的表达(P<0.05);葎草酮在10-15～10-13 mol/L浓度下可促进成骨细胞增殖、提高ALP活性以及骨矿化水平(P<0.01)、提高骨形成相关蛋白OCN、OPN的表达(P<0.05,P<0.01),在10-14、10-13 mol/L浓度下可促进BSP和BMP-2的表达(P<0.05)。在大鼠破骨细胞水平上,与对照组相比,蛇麻酮和葎草酮在10-15～10-13mol/L浓度下均可降低破骨细胞数目(P<0.01),抑制CK的表达(P<0.05,P<0.01);葎草酮在10-15～10-13 mol/L浓度下可抑制MMP-9的表达(P<0.05,P<0.01)。结论本研究在细胞水平上初步明确了蛇麻酮和葎草酮可通过促进成骨细胞骨形成、抑制破骨细胞骨吸收来防治骨丢失,为骨质疏松药物的开发提供了新资源。

葎草黄酮凝胶的制备及其对湿疹小鼠的初步药效学评价

目的 制备一种葎草黄酮外用凝胶,探讨其对湿疹的治疗作用。方法 采用溶剂提取法提取葎草中的黄酮,以卡波姆940作为凝胶基质,葎草黄酮水溶液作为分散介质,甘油作为保湿剂和增稠剂,制备葎草黄酮凝胶,对凝胶的酸碱度以及体外释放率进行质量评价。采用2,4-二硝基氯苯在小鼠背后建立特异性湿疹模型,造模成功后,连续10 d小鼠背部涂抹葎草黄酮凝胶。观察记录湿疹小鼠30 min内瘙痒次数和瘙痒持续时间,免疫组织化学方法检测湿疹小鼠背部皮损处PAR-2的表达,酶联免疫吸附法测定血浆白细胞介素(IL)-2和IL-4的含量以及皮损组织中白三烯B4(LTB4)和白三烯C4(LTC4)的含量。结果 葎草黄酮最优提取条件为液料比20∶1,提取温度70℃,提取时间90 min,提取剂浓度60%乙醇,葎草黄酮得率为1.780 3%;葎草黄酮凝胶最优制备条件为卡波姆940含量为4.72%,甘油含量为15.75%,粗黄酮含量为0.79%。制备的葎草黄酮凝胶外观呈棕黄色,均匀细腻,pH范围在6~7之间,葎草黄酮凝胶中黄酮含量为3.20 mg/g,葎草黄酮凝胶48 h的体外释放率为68%。葎草黄酮凝胶显著降低了湿疹小鼠30 min内瘙痒次数与瘙痒持续时间(P<0.01),抑制湿疹小鼠皮损中PAR-2的表达(P<0.01),上调湿疹小鼠血浆中IL-2的表达(P<0.01),下调血浆中IL-4的表达(P<0.01),减少皮损组织中LTB4和LTC4的表达水平(P<0.01)。结论 成功制备葎草黄酮凝胶。葎草黄酮凝胶可以通过调节机体Th1/Th2平衡、抗炎和止痒对湿疹小鼠发挥治疗作用。

葎草酮对人胃癌细胞SGC-7901 N-乙酰基转移酶1活性及基因表达的抑制作用

目的探讨葎草酮抗肿瘤作用以及其与N-乙酰基转移酶1(NAT1酶)之间的关系。方法采用HPLC法,以对氨基苯甲酸(PABA)为底物,测定PABA被NAT1乙酰化为乙酰化对氨基苯甲酸(Ac-PABA)的量,间接反映NAT1酶的活性。采用RT-PCR法,测定葎草酮对NAT1mRNA表达的影响。结果葎草酮能够显著降低SGC-7901完整细胞和细胞质中Ac-PABA的生成量;随着作用时间的增加,Ac-PABA的生成量逐渐增加,但与其相同时间点的阴性对照组比较,葎草酮组Ac-PABA的生成量明显减少;葎草酮能够降低SGC-7901细胞中NAT1 mRNA的表达。结论葎草酮通过抑制NAT1的活性和基因表达两个方面减少芳香胺类化合物代谢为乙酰化的芳香胺类致癌物的量,从而预防癌症的发生,防止癌症的进一步恶化。

葎草酮抑制人胃癌细胞SGC-7901 N-乙酰基转移酶1活性的酶动力学研究

目的探讨葎草酮对人胃癌SGC-7901细胞N-乙酰基转移酶1(NAT1)酶动力学常数的影响。方法采用HPLC法,以NAT1酶特异性底物对氨基苯甲酸(PABA)为底物,以SGC-7901完整细胞及细胞质内PABA被NAT1乙酰化为Ac-PABA的速度为NAT1酶的反应速率,采用双倒数作图法,以底物PABA浓度的倒数对NAT1反应速率的倒数进行直线回归,得出回归方程,计算米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。结果酶动力学研究表明,以PABA为底物,对于SGC-7901完整细胞,阴性对照组的Km和Vmax分别为(3.910±0.087)μmol/L、(0.306 0±0.006 7)pmol(1×106个细胞),葎草酮组的Km和Vmax分别为(3.830±0.123)μmol/L、(0.275 0±0.005 8)pmol(1×106个细胞),对于SGC-7901细胞质,阴性对照组的Km和Vmax分别为(760.2±210.2)μmol/L、(0.191 0±0.043 7)pmol/(mg.min),葎草酮组的Km和Vmax分别为(449.0±72.9)μmol/L和(0.094 0±0.010 4)pmol/(mg.min),数据经统计学处理表明对SGC-7901完整细胞或细胞质中的NAT1酶,阴性对照组和葎草酮组的Km没有统计学差异,而Vmax有显著差异。结论葎草酮是SGC-7901人胃癌细胞NAT1酶PABA底物的非竞争性抑制剂。

四氢异葎草酮对S_(180)荷瘤小鼠抑瘤及抗血管生成作用的研究

目的探讨四氢异葎草酮(TH)对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用及其抗血管生成作用。方法以S180荷瘤小鼠为研究对象,分组后给予不同剂量的TH,给药7d后测定抑瘤率,并运用免疫组化SABC法测定肿瘤组织微血管密度(MVD)。结果100、200mg/kgTH对S180荷瘤小鼠的抑瘤率分别达到24.84%和47.27%,瘤质量与对照组比较有显著性差异(P<0.05、0.01);TH100、200mg/kg剂量组肿瘤组织相应的MVD平均值分别为19.568和16.100,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05、0.01)。结论TH对S180小鼠实体瘤的生长具有一定的抑制作用,并可抑制肿瘤组织中的微血管生成。

葎草总黄酮对大鼠血管收缩舒张功能的作用及机制

采用血管环灌流装置,观察内皮完整的SD大鼠胸主动脉环收缩和舒张功能,探讨葎草黄酮对高糖孵育血管系统的收缩和舒张功能的影响及其机制。结果表明:葎草总黄酮(0.1、0.3、1.0 mg·L-1)能够浓度依赖性地抑制高糖诱导的血管收缩功能下降,低浓度葎草总黄酮(0.1、1.0 mg·L-1)对高糖诱导的血管舒张功能下降无明显作用,但葎草总黄酮(10.0 mg·L-1)可显著抑制高糖诱导的血管舒张功能下降。一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和鸟苷酸环化酶(GC)抑制剂亚甲蓝均可抑制葎草总黄酮改善高糖所致的血管收缩和舒张功能下降。说明葎草总黄酮可对抗高糖诱导的血管收缩和舒张功能下降,其作用机制可能是通过增加NOS活性和激动GC完成的。

高效液相色谱法同时检测啤酒中的葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸

为研究啤酒苦味物质组成,利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)建立了啤酒中的葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸的检测新技术。以高甲酸颗粒酒花为原料,60 ℃高温空气氧化后,采用Alltima C18 色谱柱分离,以体积分数为0.05%的磷酸和乙腈为流动相梯度洗脱,结合色谱图和紫外光谱特性得到葎草灵酮和希鲁酮的参考标样;用C 18 固相萃取柱(solid-phase extraction, SPE)进行样品前处理。该方法的相对标准偏差2.18%~3.59%;葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸的最小检出限分别为0.03、0.03和0.05 mg/L;回收率95%~ 115%。分析了市售不同品类啤酒中苦味物质组成,淡色Lager、皮尔森、小麦啤酒和黑啤酒中,葎草灵酮和希鲁酮含量均不高(<2 mg/L);而IPA啤酒中葎草灵酮、希鲁酮和异α-酸含量较高,且不同品牌苦味物质组成存在较大差异。该方法为后续开展葎草灵酮、希鲁酮的苦感研究及IPA啤酒苦味物质调控提供了有效的检测手段。

葎草总黄酮对溃疡性结肠炎模型大鼠保护作用的研究

目的:研究葎草总黄酮(HTF)对三硝基苯磺酸(TNBS)诱发大鼠溃疡性结肠炎(UC)的保护作用。方法:采用TNBS灌肠制备UC大鼠模型。实验分为6组,即正常对照(等容生理盐水)、模型(等容生理盐水)、柳氮磺胺嘧啶(SASP,300mg.kg-1)和HTF高、中、低剂量(450、300、150mg.kg-1)组,ig给药,每天1次,连续3周。给药结束后观察各组大鼠的临床表现和结肠损伤的情况,测定结肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量,称定胸腺、脾脏的重量。结果:与模型组比较,HTF高、中、低剂量组大鼠的临床症状显著改善,结肠黏膜的损伤程度显著减轻,病变结肠组织中MDA含量显著减少,MPO活性显著降低,SOD活性显著增强,胸腺萎缩与脾脏肿大现象明显改善,尤以HTF高剂量组效果显著。结论:HTF对TNBS诱发的UC模型具有显著保护作用,其作用机制可能与抗炎和抗自由基氧化作用有关。

高效液相色谱法分析啤酒花浸膏中的6种酸性成分

建立了啤酒花浸膏中6种酸性成分(合葎草酮、葎草酮、加葎草酮、合蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮)的高效液相色谱分析方法。分别考察了酸的加入、有机相种类及柱温对色谱分离效果的影响。在室温条件下,以HypersilODS2柱(250 mm×4.6 mm,5μm)为分析柱,以乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(pH 2.2)(65∶35,v/v)为流动相,在1.0 mL/min流速下等度洗脱,于315 nm波长下检测,啤酒花浸膏中6种酸性成分在等度洗脱下实现了基线分离。收集6种酸性成分,分别通过紫外光谱、红外光谱及质谱对其结构进行表征。结果表明该方法具有稳定、简便的优点,适用于啤酒花浸膏中酸性成分的分析。

利用HPLC法和UV法评价酒花及其异构化制品的质量

本文主要探讨了分析酒花α酸、异构酒花浸膏异α酸的HPLC法和UV（分光光度）法的优缺点及其局限性，并将HPLC法、UV法相互结合，引入“α酸含量（HPLC法）”、“β酸含量（HPLC法）”“异α酸含量（HPLC法）”、“α酸／β酸比值”、“合棒草酮／α酸比例”、“HPLC峰纯”等新的评价指标，以有效地评价酒花及异构化浸膏的质量。

气相色谱--质谱法分析异α-酸的三甲基硅烷衍生物

异构化酒花用二环己胺盐萃取后分离出反式-异α-酸,然后在二甲氧基丙烷中与六甲基二硅亚胺一起加热进行硅烷化反应,反应产物用气相色谱-质谱仪进行分析以判断反应进行的程度,结果显示衍生化反应是稳定的,进一步的研究表明可以把气相色谱-质谱法作为一种可靠的分析异α-酸的方法.

高效液相色谱法检测不同酒花浸膏中的9种味觉物质

试验采用高效液相色谱法比较不同来源酒花浸膏对异合葎草酮(Humulone)、异葎草酮(Isohumulone)、异加葎草酮(Tetrahydroisoαacid)、合葎草酮(Cohumulone)、葎草酮(Humulone)、加葎草酮(Adhumulone)、合蛇麻酮(Colupulone)、蛇麻酮(Lupulone)及加蛇麻酮(Adlupulone)9种味觉物质含量的影响。试验采用Waters YMCTMCarotenoid 3μm色谱柱(4.6 mm×150 mm),流动相A相为0.1%H_3PO_4(含0.2 mmol/L EDTA);流动相B相为乙腈,梯度洗脱,流速为1.0 m L/min,DAD检测波长为315 nm;柱温为40℃。检测方法显示:9种味觉物质的检测线性范围为0.01~500 mg/L;方法的检出限在0.02~0.2 mg/kg之间,在10~500μg/g的加标条件下的加标回收率在97.48%~105.12%之间,精密度为1.25%~3.02%(n=6),检测方法灵敏、有效。检测结果表明,不同来源酒花浸膏得到的酒花浸膏中异合葎草酮、异葎草酮、异加葎草酮、合葎草酮、葎草酮、加葎草酮、合蛇麻酮、蛇麻酮及加蛇麻酮9种酒花浸膏味觉物质的总含量以青岛大花酒花最高。