汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3双组分系统的生物信息学分析

葡糖醋杆菌是一种细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)生产菌,具有较好的生产性能。双组分系统(Two-component systems,TCSs)是细菌中最为基本的调控系统,对细菌的生理过程具有重要调控作用。本研究采用生物信息学方法系统分析了汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Konagataeibacter hansenii HDM1-3)基因组含有TCSs的分类、结构和功能。结果表明,汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3基因组含有22个组氨酸激酶(Histidine kinase,HK)和21个响应调节器(Response regulator,RR),其中包含12对配对的TCSs、4个杂合HK、7个孤儿HK和5个孤儿RR。22个HK具有20种不同的结构域组成,19个HK的C端具有HATPase_c结构域。21个RR含有9种不同的结构域组成,所有RR都含有一个或多个保守的接受(Receiver,REC)结构域。对配对的TCSs进行功能预测分析表明,汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3的TCSs可能参与的调控包括细胞分裂、生物膜形成、细菌运动性调节、群体感应、渗透压相关孔蛋白调节、铜离子流的调控、磷酸盐调节及含氮化合物的代谢等功能。本研究为后续在葡糖醋杆菌HDM1-3中开展TCSs的功能研究提供一定参考。

汉氏葡糖醋杆菌Komagataeibacter hansenii HDM1-3不同发酵时间的转录组测序分析

为了探究汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Komagataeibacter hansenii HDM1-3)在不同发酵时间的差异基因表达水平,挖掘差异表达基因在细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)生物合成代谢相关基因中的功能,利用Illumina HiSeq平台对发酵前期(18 h)和发酵后期(36 h)的Komagataeibacter hansenii HDM1-3菌株进行转录组测序分析,通过荧光定量PCR验证转录组测序结果的准确性,通过GO富集和KEGG富集分析差异表达基因。转录组测序共获得3154个CDS序列,其中57个未被注释,注释率达98.22%。差异表达基因分析表明,菌株HDM1-3发酵36 h相比于发酵18 h,共有684个显著性差异表达基因,其中上调基因369个(53.9%),下调基因315个(46.1%)。GO功能富集分析结果表明,发酵后期碳水化合物代谢相关功能基因下调,而细胞膜相关功能基因上调。KEGG富集分析结果表明,主要的能量代谢途径,包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径和柠檬酸循环都显著下调,两个BC合成酶基因显著上调。这些结果为进一步分析HDM1-3菌株BC合成相关基因、提高BC产量的研究提供理论参考。

木葡糖酸醋杆菌发酵黄酒糟酶解液产细菌纤维素的研究

该研究利用单因素比较法,分别考察了培养基组成、培养条件及黄酒糟酶解条件对木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)发酵产细菌纤维素的影响。结果表明,木葡糖酸醋杆菌BC19-2产细菌纤维素的培养基组成为黄酒糟酶解液6%、红茶2 g/100 mL;培养条件为初始pH 6.0、培养温度30℃、接种量6%;黄酒糟酶解条件为酶解时间3 h,黄酒糟酶解液体积分数90%。在此优化条件下,细菌纤维素产量最高为26.5 g/L,且性能较好,为低成本的细菌纤维素生产奠定了基础。

纤维素产生菌汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3全基因组测序分析

为全面了解汉氏葡糖醋杆菌(Komagataeibacter hansenii,K.hansenii)HDM1-3的发酵特性,为提高纤维素产量提供基因组信息,对其基因组数据进行测序分析。采用PacBio RSⅡ平台对该菌株进行全基因组测序,基因组由1个3659612 bp染色体和2个质粒组成,编码3820个蛋白质,含有7个纤维素合成酶基因。基于16S rRNA的系统发育分析表明了K.hansenii HDM1-3相对于醋酸杆菌科菌株的进化地位。在基因组中,共注释到碳水化合物活性酶88个。通过KEGG注释到代谢通路相关基因共3132个,其中碳水化合物代谢相关基因287个。通过基因组测序获得了K.hansenii HDM1-3完整的基因组信息,为改造该菌株提供了基因组学基础。

木葡糖醋杆菌发酵产细菌纤维素的培养基优化及外源物质对其代谢的影响

为了提高细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)的产量,采用响应面法优化了木葡糖醋杆菌(Gluconaceto-bacterxylinus)的发酵培养基,基于优化结果探究了海藻酸钠(SA)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、羧甲基纤维素(CMC)三种外源物质对BC合成过程中BC产量、总糖消耗、乙酸、丙酮酸等的影响。结果表明,最优培养基成分为葡萄糖4%、酵母浸粉1%、蛋白胨0.8%、MgSO_(4)1.9%、Na_(2)HPO_(4)0.2%、乙酸0.4%、乙醇1.6%,BC产量为5.19 g/L。外源添加SA、CMC-Na、CMC后,总糖的消耗量分别提高了29.9%、22.82%和15.73%,BC终产量分别为6.72、6.01和5.1 g/L。相较于对照组,SA和CMC-Na组丙酮酸含量的增幅分别为29.02%和16.52%,促进了丙酮酸的积累与利用,提高了BC的积累量。CMC添加组乙酸的积累量最高为4.27 g/L,这与BC产量的下降有一定关系。

剪切力对木葡糖醋杆菌及细菌纤维素合成的影响

以摇瓶和发酵罐两种培养体系为对象,考察了剪切力对木葡糖醋杆菌生长和细菌纤维素合成的影响。结果表明,剪切力的存在对细菌纤维素的合成不利,在添加玻璃珠的三角瓶中经9轮震荡培养后,细菌纤维素的产量降至原始菌株的23.6%;在机械搅拌罐中培养时,用剪切力大的六叶平桨进行发酵,细菌纤维素的产量最低,而用转速降低的框式桨进行发酵,细菌纤维素的产量较高。剪切力也影响木葡糖醋杆菌的形态和生长周期,剪切力的存在使细菌菌体变小,单位体积发酵液菌浓降低,菌落形态改变,菌株进入对数生长期的时间延后。实验结果为今后改进提高细菌纤维素动态培养产量提供了理论依据。

葡糖醋杆菌的研究进展

葡糖醋杆菌是醋酸菌科的一个重要属,与人类关系密切,属下部分菌株能产生细菌纤维素或乙酰胶,而另一些菌株则是植物固氮菌。综述了葡糖醋杆菌的研究进展,重点介绍了其生理生化特征、分类进展、主要应用及鉴定。

一株果醋发酵氧化葡糖杆菌的鉴定及发酵特性

从自然发酵果醋中分离和筛选到一株产醋酸的菌株E3,通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列比对及系统发育分析,鉴定菌株E3是氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）。菌株E3最适生长和产酸温度为30℃,在20℃~30℃内,菌株生长和产酸性能较稳定。菌株E3最适生长pH值为6,耐酸性较好,pH值为为3时菌体仍能生长。E3能耐受6%vol的乙醇浓度而不影响产酸能力,6%vol乙醇浓度发酵6d酸度达到4.12g/100mL。菌株E3产酸和耐酸性能好,能耐受6%乙醇浓度产酸,为果醋发酵提供了新的菌种资源。

响应面法优化葡糖醋杆菌产细菌纤维素的发酵工艺

为提高葡糖醋杆菌生产细菌纤维素的产量,采用Plackett-Burman实验设计和Box-Benhnken Design相结合,对红薯酶解液、起始pH值、装液量等因素进行了研究,优化了产细菌纤维素的发酵工艺。实验结果表明,产细菌纤维素的最佳工艺为:红薯酶解液质量浓度50 g/L、起始pH值6.0、装液量50 mL/(250 mL)。该工艺条件下得到的细菌纤维素绝干质量(折算成质量浓度)达到4.80g/L,比优化前产量2.20 g/L提高了118%。

葡糖醋杆菌利用黄水发酵生产细菌纤维素

为探究葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)利用黄水生产细菌纤维素的可行性,将黄水按不同体积比添加到传统发酵液(HS培养基)中,接种葡糖醋杆菌至发酵液中30℃静置培养7 d,测定发酵过程中的细菌纤维素产量、还原糖含量等理化指标。结果表明,在HS培养基中添加黄水可以显著地增加细菌纤维素的产量(P<0.05),黄水的最佳体积比为40%。在此条件下,细菌纤维素产量为5.93 g/L,比HS培养基(2.20 g/L)提高了169.5%;糖转化效率提高了148.9%;从第2天开始,单日细菌纤维素产量均>0.70 g/L,第5天产量最高为1.14 g/L,单日糖转化效率均高于同时期的HS培养基;p H值维持在4.60~5.50之间。在扩大浅圆盘发酵中,40%黄水-HS培养基中细菌纤维产量为3.48 g/L,比HS培养基(1.62 g/L)提高了114.8%。

葡糖醋杆菌RZS01发酵产细菌纤维素的研究

采用葡糖醋杆菌(Komagataeibacter nataicola)RSZ01进行细菌纤维素发酵试验,利用单因素和正交试验对发酵培养基组成进行优化,并研究了菌株保藏时间、接种量和培养基初始p H对BC产量的影响。结果表明,保藏期限在30 d以内的菌种可基本保证BC产量;在接种量为8%、初始pH值为5.2时,最优发酵培养基组成为:葡萄糖2.50%,蔗糖3.00%,玉米浆2.2%,磷酸二氢钾0.35%,硫酸铵0.125%。在此条件下,葡糖醋杆菌RSZ01发酵产细菌纤维素的产量为12.05 g/L。

葡糖醋杆菌FBFS97产苯乳酸的液态发酵条件优化

该试验以葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)FBFS97为出发菌株,在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken响应面法优化菌株产苯乳酸的液态发酵条件。结果表明,优化后的发酵条件为果糖100 g/L、酵母粉40 g/L、K2HPO41.2 g/L,pH 4.4,接种量5%(V/V),装液量24 mL/250 mL,于28℃、150 r/min培养8 d。在此优化条件下,苯乳酸产量为217 mg/L,是优化前的3.52倍。

葡糖醋杆菌高静水压诱变株AFLP体系的建立

【目的】从DNA分子水平研究葡糖醋杆菌及其经高静水压诱变后所得突变株的差异,优化建立了适合葡糖醋杆菌的AFLP技术体系,为细菌纤维素产生菌的高静水压诱变育种提供技术支撑。【方法】以1株从自制醋中分离出来的细菌纤维素产生菌J2及其经高静水压诱变后得到的高产细菌纤维素的突变株M438为材料,对选择性扩增程序的影响因素进行分析,优化建立葡糖醋杆菌的AFLP酶切体系,并对适合葡糖醋杆菌高压诱变前后差异分析的引物组合进行筛选。【结果】酶切模板DNA用量600 ng,酶切时间8 h,过夜连接（反应时间大于10 h）,预扩增产物最适稀释倍数为500倍,从24对AFLP选择性扩增引物组合中筛选出了E-T/M-G为适合葡糖醋杆菌高静水压诱变前后差异分析的引物组合。供试2株菌的选择性扩增差异位点只有1处,经测序扩增片段长度为213 bp,提交Genbank比对,其与Gluconacetobacter hanseniiATCC23769 GXY0064基因组序列中24 917~24 723 bp片段相似度为99%。【结论】所建立的AFLP反应体系,适合葡糖醋杆菌J2及其突变株M438的AFLP分析。

筛网对木葡糖醋杆菌变异的控制

以1 000 m L烧杯为容器,木葡糖醋杆菌在静置培养时,培养液体积为100 m L时,没有变异;增至300 m L时,发生变异,纤维素产量下降38.8%,培养液体积增至700 m L时,变异菌数量高达1.3×106 CFU/m L,纤维素产量下降76.3%;120 r/min振荡培养更易发生变异,两种方式培养下的变异现象通过筛网使用而得到控制,从而提高了纤维素产量。

绿色荧光蛋白基因在木葡糖酸醋杆菌中的表达

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)广泛应用于报告基因、基因的表达与调控以及微生物信号传导.以p MV24穿梭质粒为载体,实现了GFP在木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)中的成功表达.采用PCR技术扩增出绿色荧光蛋白基因,连接至木葡糖酸醋杆菌表达载体p MV24中,构建成功的质粒命名为p MV24-gfp+.采用电转化技术将重组载体导入木葡糖酸醋杆菌中,转化子在荧光显微镜的蓝色激发光下发出绿色荧光,为木葡糖酸醋杆菌趋化性的观察及菌体中运动蛋白的分析提供了重要的理论依据.

糖及乙醇对木葡糖酸醋杆菌种子液活力的影响

为评估糖及乙醇对种子液活力的影响,制备含不同糖源无乙醇和添加乙醇的种子液,将种子液接种至生产培养基中,通过测定纤维素产量来评价其活力;同时将这种影响分为静置和振荡培养2种模式下进行研究。结果显示:种子液代数增加,无论是静置方式还是振摇方式,种子液活力随转接次数增加而下降,但这种下降的趋势因糖的种类不同而异,以2%葡萄糖为糖源时,下降趋势更缓,如果添加1%vol的乙醇,因为乙醇有增菌作用,下降趋势得到缓解。静置方式与振摇方式相比,更能保持菌种的活力。

葡糖酸醋杆菌内源复制片段的克隆

采用改进的碱裂解法提取Gluconacetobacter hansenii ATCC23769自发不产膜突变体的内源隐蔽质粒。用不同的限制性内切酶对混合质粒直接进行酶切,酶切后的片段混合物与pUC18载体连接构建重组载体。重组载体回转入G.hansenii ATCC23769获得隐蔽质粒上具有复制能力的片段,序列结果分析表明:该片段上没有某些其他质粒所具有的Rep蛋白。利用该片段,构建了能同时在大肠杆菌和葡糖酸醋杆菌中复制的质粒载体,体内的抗生素抗性实验证明该载体具有良好的稳定性。

木葡糖醋杆菌静置培养中的衰退现象初探

Gluconacetobacter xylinus在振摇培养时易衰退,静置培养中却鲜见。经实验证明,静置培养,连续转接中,当容器为锥形量杯时易衰退;当容器为三角瓶,装液量越大,发酵时间越长,越易衰退。推测木葡糖醋杆菌静置培养中的衰退与其低氧胁迫的浓度及时间紧密相关。

产细菌纤维素菌株中间葡糖醋杆菌的分离与发酵条件优化

从中国传统固态发酵食醋醋醅中分离出5株产细菌纤维素(BC)的菌株,经生理生化特征及16S rDNA序列分析,它们均属于中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius),其中编号为1-17的菌株初始产量较高。应用扫描电镜技术(SEM)和傅里叶红外光谱技术(FT-IR)分析了BC结构特征。采用单因素研究了温度、培养时间、碳源、初始pH对BC合成的影响。确定菌株1-17最适温度为35℃,发酵时间为7d,甘油和葡萄糖为最适碳源,最适初始pH为6.0,乳酸根离子和钙离子能够促进BC的合成。通过培养条件优化使得细菌纤维素产量从初始的(3.90±0.08)g/L增加到(7.90±0.19)g/L。

葡糖醋杆菌J2-1静态发酵生产细菌纤维素的培养基优化

为提高葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)J2-1发酵生产细菌纤维素的产量,采用静态发酵方式,利用单因素试验对发酵培养基的碳源、氮源、乙醇、有机酸及无机盐进行优化,并在此基础上选取葡萄糖、Mg SO4·7H2O和酵母粉添加量进行正交试验优化。结果表明,发酵培养基最优组分为:葡萄糖80 g/L、酵母粉18 g/L、乙醇2%(V/V)、Na2HPO4·12H2O 3 g/L、乳酸2 g/L、Mg SO4·7H2O 0.4 g/L。在此优化发酵培养基条件下,葡糖醋杆菌J2-1静态发酵生产细菌纤维素产量达到9.34 g/L,是优化前的1.89倍。