葡萄根癌病菌的快速检测技术

根据葡萄根癌病菌核糖体基因间隔片段(16S-23S Ribosomal DNA Intergenic Spacer,ITS)特异区域设计,合成了一对引物,建立了快速检测葡萄根癌病菌的PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。结果表明:只有葡萄根癌病菌能扩增出大小为758 bp的特异性条带,而非葡萄根癌病菌均未能扩增出任何条带。检测灵敏度达10个细菌/μL左右,且稳定性好,经多次反复冻融,扩增条带未发现有明显变化。通过对田间病样进行检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速(4 h左右完成检测)、灵敏度高、特异性强、重复性和稳定性好等优点。

应用巢式PCR检测葡萄根癌病菌

为建立葡萄根癌病菌的分子检测方法,应用细菌核糖体基因间隔片段(16S～23S ribosomal DNA inter-genic spacer,ITS)通用扩增引物1405f/456r和葡萄根癌病菌ITS特异引物fI/rI,采用巢式PCR(Nested-PCR)技术对2株葡萄根癌病菌[即葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)]和10株非葡萄根癌病菌进行扩增,并且对接种葡萄根癌病菌的葡萄植株进行检测。结果表明,仅有葡萄根癌病菌能扩增出1条长度为607 bp的片段;巢式PCR检测方法可从接种15 d后的葡萄植株中特异性检测出病原菌,而病症的出现需要30～35 d的时间。说明该研究建立的巢式PCR方法可用于快速检测葡萄根癌病菌。

生防葡萄土壤杆菌E26菌株的GFP标记

葡萄根癌病是一种在生产上造成重大经济损失的世界性病害。无致病性的葡萄土壤杆菌E26菌株(Agrobacterium vitis E26)可以有效防治葡萄根癌病,是很有应用前景的生防菌株。借助含有Mini-Tn5和绿色荧光蛋白基因gfp的自杀性载体pAG408将gfp基因导入葡萄土壤杆菌E26菌株,获得了在紫外光下发出强烈绿色荧光的E26突变株,命名为E26 (gfp)。遗传传代法检测表明E26(gfp)中gfp稳定表达。E26(gfp)在固体培养基、液体培养基和葡萄茎外植体的生长与野生型E26相比均没有显著差异。E26(gfp)对葡萄根癌病菌的平板抑制作用和温室防病效果与野生型E2相比也均没有显著差异。gfp的插入对E26生防性状的表达没有影响。GFP标记是研究E26菌株在自然环境生存动态的有用工具。