葡萄糖激酶新发基因突变致MODY2一家系的临床及分子遗传学分析

目的报道1例中国人葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)新发基因突变导致青少年起病的成人型糖尿病2型(maturity-onset diabetes of the young,type 2,MODY2)家系,分析其遗传学特征及临床特点。方法对1例MODY2家系行基因测序、临床资料采集及分析。结果调查此家系成员共18人,其中先证者及其弟、父亲、叔父、堂弟等父系成员11人罹患糖尿病;先证者及其弟、父亲、叔父均存在GCK基因杂合同义突变(exon1:c.45G>A:p.K15K),生物信息学功能预测提示该突变可能影响mRNA剪接而致GCK功能受损,国内研究人群尚未见此突变报道;先证者及其弟糖化血红蛋白分别为6.49%、6.72%,空腹血糖分别为6.80、7.01 mmol/L,糖尿病自身抗体谱均为阴性,6~18个月随访示血糖水平保持稳定。结论此MODY2家系中GCK基因杂合同义突变(exon1:c.45G>A:p.K15K)为中国人新发突变位点,其临床表现为轻度、持续稳定的空腹高血糖及糖化血红蛋白升高,不应低估GCK基因同义突变的致病性。

小檗碱对NIT-1细胞胰岛素分泌和葡萄糖激酶活性的影响

本文探讨小檗碱对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响及其分子机制。采用不同浓度小檗碱干预NIT-1细胞后,以放射免疫法、液体闪烁计数法、酶法分析及Western blotting分别检测其胰岛素水平、葡萄糖利用、葡萄糖激酶(GK)活性、GK和葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)的表达。结果表明,在高浓度葡萄糖刺激下,与空白对照组相比,小檗碱组的NIT-1细胞胰岛素分泌增加、葡萄糖利用活跃,且GK酶活性增强、GK表达增加,而GKRP表达降低(P<0.05)。结果表明,小檗碱促进NIT-1细胞高浓度葡萄糖诱导的胰岛素分泌,可能与其作为GK激活剂,使NIT-1细胞葡萄糖利用增加、GK酶活性及表达增强有关。

饲料脂肪对翘嘴红鲌生长、葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性与基因表达的影响

选用360尾翘嘴红鲌(Erythrocutler ilishaeformis Bleeker),体质量约40g。随机分成为2组,分别为高脂组(脂肪质量分数19.93%,碳水化合物质量分数14.45%)、低脂组(脂肪质量分数9.92%,碳水化合物质量分数12.38%),每组设3个重复,饲养8周。分别于摄食后0h、3h、6h、12h、24h测定血液指标、糖代谢酶葡萄糖激酶(Glucokinase,GK,E.C.2.7.1.1)以及葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase,E.C.3.1.3.9)活性及基因表达,并分析高脂肪与低脂肪水平日粮对翘嘴红鲌生长的影响。与低脂水平日粮相比,高脂水平日粮组血液甘油三酯水平和游离脂肪酸水平分别在摄食后3h、12h有增加现象,肝胰脏粗蛋白与脂肪含量有显著增加(P<0.05)。与低脂水平日粮相比,在摄食后3～12h高脂肪水平日粮组糖代谢酶GK的mRNA水平显著增加(P<0.05),但是日粮脂肪水平并不能显著影响GK活性(P>0.05)。在摄食后3～24h高脂肪水平日粮组糖代谢酶G6Pase的mRNA水平得到显著促进,并在摄食后24hG6Pase活性显著增加(P<0.05)。因此,摄食高脂肪水平日粮能增加肝胰脏粗蛋白与脂肪含量,造成翘嘴红鲌高血糖效应,诱导G6Pase酶活性及基因的表达,这可能是影响翘嘴红鲌碳水化合物利用的原因之一。

小檗碱对HepG2细胞葡萄糖激酶活性及其mRNA表达的影响

目的探讨小檗碱对HepG2细胞葡萄糖激酶活性和基因表达的影响。方法体外培养HepG2细胞,使用不同浓度的小檗碱(0,5,15,45,100μmol.L-1)以及作为阳性对照的生物素[1,2]组作用24h后,检测细胞增殖能力、葡萄糖激酶活性及其mRNA的表达、葡萄糖激酶下级产物糖原含量。结果小檗碱浓度低于5μmol.L-1时对HepG2细胞增殖无明显影响,在15μmol.L-1浓度以上对细胞增殖的抑制作用随浓度增加而加强;葡萄糖激酶的活性随着小檗碱的浓度增加而提高,而且HepG2细胞糖原含量以及葡萄糖激酶mRNA的表达在一定范围内也与小檗碱的浓度呈正相关。结论小檗碱能够提高HepG2细胞葡萄糖激酶的活性和葡萄糖激酶mRNA的表达。

小檗碱对胰岛素抵抗大鼠肝脏葡萄糖激酶及其调节蛋白的影响

目的:研究小檗碱对胰岛素抵抗大鼠肝脏葡萄糖激酶(GK)活性及肝脏GK与葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)表达的影响．方法:选用♂Wistar大鼠,以高脂高热量饲料喂养8 wk,复制胰岛素抵抗大鼠模型,成模后随机分成模型组、小檗碱组、二甲双胍组,各药干预4 wk后,比较各组大鼠胰岛素敏感性、肝糖原、肝脏GK活性、肝脏GK与GKRP蛋白(Western blot法)表达的差异．结果:比模型组比较,小檗碱组胰岛素敏感性提高(-4．93±0．30 vs-5．35±0．40,P<0．05),肝糖原含量明显升高(136．58±52．57μg／g vs 65．88±27．80μg／g,P<0．05),肝脏GK活性升高(226．55±10．62μkat／g vs 92．69±6．43μkat／g, P<0．05),肝脏GK蛋白表达增强(1．71±0．49 vs 1．24±0．22,P<0．05),而GKRP表达减弱(1．19±0．20 vs．94±0．56,P<0．01):与二甲双胍组比较,小檗碱组肝糖原含量高(136．584±52．574μg/g vs 89．427±31．971μg/g,P<0．05),余指标无显著性差异(P>0．05)．结论:小檗碱改善胰岛素抵抗的作用机制可能与提高肝脏GK活性有关．

小檗碱对胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠葡萄糖激酶相关糖代谢的影响

目的探讨小檗碱对胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠肝脏葡萄糖激酶(GK)相关糖代谢的影响。方法观察小檗碱对实验性胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠空腹血糖、血清胰岛素(INS)、糖原、肝脏乳酸(LA)、GK活性及其蛋白表达的影响。结果与模型组比较,小檗碱组大鼠血清空腹血糖水平明显降低,而INS、肝脏LA无明显变化,肝糖原合成增多、GK活性及其蛋白表达明显增高。结论小檗碱能调节胰岛素分泌缺陷型糖尿病大鼠糖代谢,这可能与其促进GK活性及其蛋白表达有关。

彭泽鲫葡萄糖激酶基因全长cDNA克隆及表达分析

本试验采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆获得了彭泽鲫(Caras-sius auratusvar.Pengze)葡萄糖激酶(GK)基因全长cDNA序列。结果表明,该cDNA全长2 050bp,含1个1 431bp的开放阅读框(ORF),编码476个氨基酸,GK蛋白计算分子量为53.78ku,等电点为5.14。彭泽鲫GK氨基酸序列的ATP结合位点、葡萄糖结合位点、己糖激酶标签序列、N-连接糖基化位点、细胞黏附序列和糖胺聚糖黏附位点等主要功能位点与其他脊椎动物相比基本保守。彭泽鲫GK氨基酸序列与建鲤、人和鼠GK氨基酸序列相似百分比分别为98.1%、79.8%和79.1%。以β-actin为内标,采用半定量RT-PCR方法对GK基因在彭泽鲫大脑、白肌、脾脏、肠系膜脂肪和肝胰脏各组织中的表达进行了研究。结果表明,GK基因主要在肝胰脏中表达;在脾脏、肠系膜脂肪和大脑中也检测到微量表达,但表达量显著低于肝胰脏(P<0.05);白肌中没有检测到GK基因表达。

常见型非胰岛素依赖型糖尿病患者的葡萄糖激酶基因分子扫查

对３０例起病于４５岁或以前及／或伴糖尿病家族史的中国人常见型非胰岛素依赖型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者，进行葡萄糖激酶基因（ＧＣＫ）编码区及拼接区分子扫查。就扫查中发现的突变／变异，进一步在５６例ＮＩＤＤＭ者及１３４例非糖尿病患者中筛查，确认其频率。结果表明：①分子扫查未见ＧＣＫ编码区及拼接区突变，提示此类突变不是中国人常见型ＮＩＤＤＭ主要病因。②中国人常见型ＮＩＤＤＭ中，尤其是起病早及伴有明显糖尿病家族史者，可伴ＧＣＫ内含子１ｂ变异，此种变异未见于非糖尿病患者（４．７％比０％，Ｆｉｓｈｅｒ确切Ｐ值＝０．０２２）。此变异是否影响ＧＣＫ表达尚待阐明。

糖脉交泰胶囊对高糖高脂糖尿病大鼠糖脂代谢及肝脏葡萄糖激酶、低密度脂蛋白受体的影响

目的研究糖脉交泰胶囊对高糖高脂糖尿病大鼠糖脂代谢及肝脏葡萄糖激酶(GCK)、低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白表达的影响。方法高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素(STZ,35 mg.kg-1)联合诱导制备高糖高脂糖尿病大鼠模型,并随机分组为正常对照组、模型组、糖脉交泰组和吡格列酮组,每组8只,给予相应的药物治疗4周。实验结束后比较各组空腹血糖值(FBG)、糖化血清蛋白(GSP)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)及肝糖原等指标;Western blot法检测肝脏组织中GCK和LDLR蛋白表达。结果与模型组比较,糖脉交泰胶囊能明显降低大鼠FBG、HbA1c、GSP水平,明显改善TC、TG、LDL-C等指标(P<0.05);肝脏肝糖原含量及LDLR和GCK的蛋白表达均明显增加(P<0.05)。结论糖脉交泰胶囊具有明显的调节糖脂代谢的作用,其作用机制与其提高肝糖原的含量,增加肝脏GCK和LDLR蛋白表达相关联。

吡啶类葡萄糖激酶激动剂的三维定量构效关系分析

葡萄糖激酶GK是调节体内葡萄糖代谢和参与血糖动态平衡的主要靶点之一。本文针对46个具有GK激动剂活性的吡啶类衍生化合物进行构效关系研究,研究了其结构与活性的关系。基于分子共同骨架叠合用分子力场分析法(COMFA),比较分子相似指数法(COMSIA)两种经典三维定量构效关系(3D-QSAR)方法,建立相应模型,进行分子结构和抗糖尿病活性分析。COMFA模型的交叉验证系数q^2为0.613,相关系数r^2为0.989;COMSIA模型交叉验证系数q^2为0.621,相关系数r^2为0.982。数据证明两种模型都显示出较好的预测性,为设计新的活性更高的小分子激动剂提供了可靠信息。

烫伤大鼠肝葡萄糖激酶、肌己糖激酶活性及红细胞三磷酸腺苷含量的变化

为进一步探讨损伤后糖代谢状况，我们测定了３０％体表烫伤后大鼠不同时间的血糖和血乳酸，并比较休克期（伤后６ｈ）和高代谢期（伤后７２ｈ）的肝葡萄糖激酶及比目鱼肌已糖激酶（Ⅱ型）活性。结果显示血乳酸水平在伤后６ｈ和４８ｈ各有一个高峰，可能分别是应激和代谢紊乱的表现。血糖水平在伤后６ｈ明显升高，但６ｈ内波动很大。伤后７２ｈ肝葡萄糖激酶活性显著降低（Ｐ＜０．０５），可能与创伤后血糖升高，糖异生增强及胰岛素抵抗等现象有关。伤后比目鱼肌已糖激酶活性及红细胞三磷酸腺苷（ＡＴＰ）含量未发现明显变化。

脂联素对大鼠肝细胞葡萄糖激酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性影响的研究

目的:探讨脂联素对体外培养大鼠肝脏细胞葡萄糖激酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性影响,及其在胰岛素抵抗中的意义。方法:以BRL肝脏细胞株为细胞模型,分别用10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml脂联素处理细胞,用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法、乳酸脱氢酶偶联比色法检测大鼠肝脏细胞葡萄糖激酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性。结果:与对照组比较,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在脂联素处理24h后活性明显降低,且随脂联素浓度升高作用越明显,P<0.05。葡萄糖激酶在脂联素处理24小时后,活性与对照组比较没有显著性差异,P>0.5。结论:脂联素对葡萄糖激酶无明显的调节作用,而对于磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶具有显著的抑制作用。脂联素通过对肝细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性的调节,降低肝脏葡萄糖异生,减少肝糖输出,改善胰岛素抵抗。

小檗碱对肝细胞核因子4α表达及葡萄糖激酶活性的影响

目的:观察小檗碱对小鼠原代肝细胞核因子4α(HNF4α)表达及葡萄糖代谢关键酶葡萄糖激酶(GK)活性的影响,探讨小檗碱治疗2型糖尿病的分子机制。方法:采用改良两步灌流法培养小鼠原代肝细胞,用不同浓度的小檗碱(0,1,3,10,30,100μmol.L-1)和1 mmol.L-1二甲双胍干预24 h后,采用RT-PCR方法检测HNF4αmRNA表达;采用Western-blot方法检测HNF4α蛋白的表达,同时检测GK的活性。结果:与阴性对照组相比,小檗碱在10,30,100μmol.L-1时能够明显促进HNF4αmRNA及蛋白的表达,二者同时在30μmol.L-1时达到最大值(HNF4αmRNA相对吸光度为0.48±0.20,蛋白相对吸光度为3.47±0.86,P<0.01);在10,30μmol.L-1时明显上调GK活性,同时在30μmol.L-1时达到最大值(0.080±0.073,P<0.05);而二甲双胍对HNF4αmRNA、蛋白的表达及对GK活性的影响则与阴性对照组无明显差异。结论:小檗碱改善糖代谢的作用可能与其调节肝细胞核因子4α的表达进而调节GK活性有关。

2型糖尿病患者葡萄糖激酶基因多态性的研究

目的 研究天津地区人群中葡萄糖激酶基因多态性与 2型糖尿病的关系。 方法 应用聚合酶链反应对天津地区的 4 3例 2型糖尿病患者与 4 6名正常对照个体的葡萄糖激酶基因的 3’末端 -10Kb处的 1个 (CA) n 重复片段的多态性进行了研究。 结果 在葡萄糖激酶基因中存在 5种等位基因(a、b、c、d、e等位基因 ) ,其中a等位基因频率在对照组 30 %、糖尿病组 16 % ,两组差异有显著意义 (P =0 .0 2 6 ) ,e等位基因频率在糖尿病组明显高于对照组 ,分别为 2 7%和 13% ,两组差异有非常显著意义 (P=0 .0 11)。在调整年龄、性别和体重指数后 ,e等位基因仍与 2型糖尿病存在特异性关系 (P <0 .0 5 )。 结论 葡萄糖激酶基因 (CA)n重复片段多态性可能是天津地区人群中

葡萄糖激酶基因多态性与妊娠期糖尿病遗传易感性的关系

目的探讨葡萄糖激酶(GCK)基因-259位点单核苷酸多态性与妊娠期糖尿病(GDM)发病的关系。方法应用PCR-RFLP技术对80例GDM孕妇(GDM组)和80例正常孕妇(对照组)的GCK基因-259位点(A→T)进行单核苷酸多态性分析。结果两组GCK基因-259位点各基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验,具有群体代表性;GDM组GCK基因-259位点T等位基因频率高于对照组(P<0.05),A等位基因频率、A/A基因型频率无统计学差异(P>0.05),T/T基因型频率与GDM组呈正相关(OR值为3.235,P=0.031),结论GCK基因-259位点单核苷酸多态性可能在GDM遗传易感性中起重要作用;T等位基因可能与GDM发生有关。

小檗碱对2型糖尿病中国地鼠肝脏葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA表达的影响

目的研究小檗碱对2型糖尿病中国地鼠肝脏葡萄糖激酶(GcK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA表达的影响,探讨小檗碱影响糖代谢的分子机制。方法以高脂高热量饲料喂养结合腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法制作2型糖尿病中国地鼠模型,成模后随机分成模型组、小檗碱组、二甲双胍组,各药干预9周。同时设立对照组。观察小檗碱疗效及对肝脏GcK、G6P、PEPCK mRNA表达的影响。结果与模型组相比,小檗碱增强胰岛素敏感性,降低血糖血脂,增高肝脏GcK的mRNA表达,降低肝脏G6P、PEPCK mRNA的表达。结论小檗碱降低2型糖尿病血糖的作用机制可能与提高肝脏GcK mRNA的表达和降低G6P、PEPCK mRNA的表达有关。

中国迟发型2型糖尿病患者葡萄糖激酶基因突变研究

目的 :探讨中国迟发型 2型糖尿病患者葡萄糖激酶 ( glucokinase ,GCK)基因的突变情况。方法 :收集了中国汉族 47个迟发型 2型糖尿病 (late onsetType 2diabetes)家系 ,应用多聚酶链反应 单链构像多态性 ( polymerasechainreaction singlestrandconformationpolymorphism ,PCR SSCP)的分析方法 ,对先证者GCK基因 12个外显子进行突变检测。结果 :6 ,9号外显子SSCP电泳时 ,出现异常电泳条带。测序证实在 6号内含子 38bp处发生C→T的单个碱基改变 ,变异基因频率为 35 .1%;9号内含子 8bp处发生C→T的单个碱基改变 ,变异基因频率为5 7.5 %。结论 :发现了中国人两个单核苷酸多态位点 :IVS6%D 38C→T ;IVS9%D 8C→T。GCK基因突变不是中国汉族迟发型 2型糖尿病的主要致病原因。

葡萄糖激酶调节蛋白基因rs780094多态性与冠心病痰瘀互阻证的关系探讨

目的分析葡萄糖激酶调节蛋白基因rs780094多态性与冠心病痰瘀互阻证之间的关系。方法收集206例冠心病病人病史及实验室数据资料,提取DNA测序并进行rs780094多态性分析。依据是否为痰瘀互阻证将病人分为两组,进行统计分析。结果痰瘀互阻证冠心病病人较非痰瘀互阻证病人的血糖稍高[(6.09±2.36)mmol/L与(5.98±2.13)mmol/L,P=0.574],但未达到统计学意义。冠心病痰瘀互阻组中,rs780094 CC基因型的比例高于非痰瘀互阻证组(28.75%与14.29%,P=0.013),其等位基因C的比例也高于非痰瘀互阻证组(53.75%与39.68%,P=0.006)。Logistic回归结果显示,rs780094 CC基因型与冠心病痰瘀互阻证显著相关。结论冠心病痰瘀互阻证型与rs780094多态性存在显著关联,其分子机制有待进一步研究。

葡萄球菌激酶(Sak)的基因克隆和高效表达工程菌的构建

利用ＰＣＲ技术，从金黄色葡萄球菌中扩增Ｓａｋ基因并将其克隆到ｐＵＣ１９质粒上，确认其碱基序列正确后，再将其亚克隆到ｐＪＷ２质粒并转化大肠杆菌ＤＨ５α获Ｓａｋ高表达工程菌（ＤＨ５α／ｐＪＳ）。试验结果表明，Ｓａｋ可占菌体总蛋白的５０％。