基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。

抗B型葡萄球菌肠毒素(SEB)单克隆抗体的研制及其初步鉴定(简报)

葡萄球菌肠毒素是一组分子量为24,000—34，000的单肽链蛋白质。已知有SEA、SEB、SECs(包括SEC1，SEC2及SEC8)，SED及SEE等血清型。都能引起食物中毒。并证实SEA和SEB还具有强烈的有丝分裂原效应。对机体可产生广泛地免疫调节作用。因此，建立抗SEB单抗的杂交癌细胞系具有重要的实际意义。

葡萄球菌B型肠毒素突变体SEB(Y89A,C93S,Y94A)对小鼠的免疫保护作用

目的:评价葡萄球菌B型肠毒素(SEB)突变体SEB(Y89A,C93S,Y94A)作为超抗原疫苗候选分子对小鼠的免疫保护作用。方法:制备具有一定纯度和活性的突变体蛋白SEB(Y89A,C93S,Y94A)样品,灭活后免疫BALB/c小鼠,待小鼠抗体水平上升后,再以野生型SEB(wt-SEB)攻击用D-半乳糖胺致敏的BALB/c小鼠,评价该突变体蛋白的免疫保护作用。结果:突变体蛋白SEB(Y89A,C93S,Y94A)在重组大肠杆菌DH5α中得到表达,主要以包涵体形式存在,经变性、复性、SephacrylS200凝胶过滤,制备成较高纯度(95%)的、具有与wt-SEB相同抗原性的突变体蛋白样品,甲醛灭活后免疫BALB/c小鼠至4周,ELISA法测定小鼠抗体效价水平可达106;进而以wt-SEB攻毒,在达8倍LD50的攻击下,阴性对照小鼠在24h内全部死亡,而SEB(Y89A,C93S,Y94A)组与wt-SEB组小鼠至48h仍有存活。结论:突变体蛋白的保护效果与wt-SEB相类似,有望成为SEB减毒疫苗候选分子。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约 70 0bp的DNA片段 ,将之克隆到pGEM 7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因 ,它含有 717bp(不包括N端81bp的信号肽编码区 ) ,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体 7ZTS上 ,转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)内。表达的SEB占总蛋白 33.5 %。

重组葡萄球菌B型肠毒素超抗原的制备及抗肿瘤活性分析

目的 采用基因工程技术制备葡萄球菌B型肠毒素 (SEB) ,并对其体内外抗肿瘤活性进行分析。方法 对SEB在大肠杆菌中进行高效表达和分离纯化 ,并对其超抗原活性和免疫学活性与天然SEB进行比较研究。观察重组SEB对人肝癌细胞的体外抑制作用 ,以及对小鼠肝癌和肉瘤的体内抑瘤效果。结果 SEB获得高效表达 ,并一步将其纯化至均质。与天然毒素相比较 ,重组SEB的免疫学活性与超抗原活性基本相似。首次证明 ,即使SEB的浓度为 10ng/L ,仍然对人肝癌细胞有显著地抑制作用 ,其对小鼠体内的肝癌和肉瘤有一定的抑制作用。结论 重组SEB在体内外均有一定肿瘤抑制作用 。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的 :金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一 ,针对进出口食品卫生监测的需要 ,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法 :利用聚合酶链反应技术 (PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交 ,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对 ,来判断阴阳性结果。结果 :本方法检出率高 ,每克样品中有 4个金黄色葡萄球菌即可检出 ,2 4小时即可报告结果。结论 :PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确 ,检测周期短 ,既可提高检出率 ,又可节省检测时间。

红细胞在葡萄球菌肠毒素B刺激人PBMC增殖中的辅佐作用

通过葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激人外周血淋巴细胞增殖,对完整红细胞及红细胞膜能否在提呈抗原中起辅佐作用进行了研究,并与单核细胞的辅佐作用进行了对比。结果显示,在SEB刺激去除单核细胞的人外周血淋巴细胞中,分别加入红细胞、红细胞膜碎片或单核细胞后,淋巴细胞增殖均有明显升高(P<0.01)。当同时加入红细胞和单核细胞时,淋巴细胞增殖的幅度略高于单独加入红细胞或单核细胞组。提示红细胞具有与单核细胞作用类似而机理不同的辅佐作用。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的培养产毒与柱层析纯化

本文采用玻璃纸覆盖琼脂平板法,在37℃培养金黄色葡萄球菌48h后,收集菌体,10000×g离心15min,上清液经聚乙二醇20000浓缩。浓缩液依次经羧甲基阳离子交换纤维素CM-32层析和葡聚糖凝胶SephadexG-75过滤纯化,获得电泳纯的金黄色葡萄球菌B型肠毒素。实验证明,利用该简化的二步柱层析分离得到的金黄色葡萄球菌B型肠毒素完全能满足血清学检实验和鉴定的要求,方法简便易行,一般实验室均可使用。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对豚鼠哮喘模型Th1/Th2细胞因子的影响

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)对豚鼠支气管哮喘(简称哮喘)模型气道炎症及Th1/Th2细胞因子的影响。方法27只豚鼠随机分为对照组,模型组,SEB组各9只,用卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型。末次激发豚鼠24-48 h内处理,支气管肺泡灌洗,直接记数总白细胞和嗜酸性粒细胞,观察肺组织病理改变,分装冻存支气管肺泡灌洗液做细胞因子检测。结果SEB组豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量为(2.6±0.64)×106,显著低于模型组的(13.0±1.8)×106(P<0.01);肺组织哮喘炎症反应也轻于模型组;SEB组肺泡灌洗液中Th1细胞因子IFNγ-浓度(126.41±5.17)pg/mL,高于模型组(86.52±5.10)pg/mL(P<0.05);而Th2细胞因子IL-4浓度(50.02±2.79)pg/mL低于模型组(78.30±3.88)pg/mL(P<0.05)。结论SEB能减少哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量,可以通过调节Th1/Th2细胞因子的比值来减轻气道哮喘炎症反应。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrapTMchelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。

乳品中金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫传感检测方法的研究

本文利用自制的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)抗体构建了一种L-半胱氨酸和纳米金的双层自组装免疫传感器,采用循环伏安法及交流阻抗法对传感器进行表征与测定,并对各项相关条件进行优化,最终建立了SEB检测的标准曲线,线性范围分别在2～10 ng/mL和10～100 ng/mL,相关系数分别为0.9939和0.9926,检出限(S/N=3)为0.667 ng/mL,乳品检测回收率在84.3%～93.2%之间。该传感器特异性良好,稳定性好,可再生使用,可应用于乳品中SEB的快速检测。

从噬菌体表面展示肽库中筛选葡萄球菌B型肠毒素抑制剂

通过生物淘选,从噬菌体表面展示12肽肽库中筛选能与葡萄球菌B型肠毒素(staphylococcalenterotoxinB ,SEB)结合且能抑制其肠毒活性的特异性短肽.采用Phage ELISA和MTT鉴定所得目的肽的亲和性;根据优势噬菌体阳性克隆序列合成相应多肽.利用竞争ELISA研究合成肽与SEB单克隆抗体竞争结合SEB的情况;通过动物实验考察其抑制SEB的超抗原特性和肠毒活性情况.筛选所得短肽在一定浓度范围内可以抑制SEB对鼠脾淋巴细胞的激活;合成肽与SEB质量比为16 0∶1时,合成肽可较好地抑制SEB对乳猫的肠毒活性,并对SEB引起的小鼠致死具有明显保护作用.结果表明,初步得到了能与SEB特异结合并能抑制SEB超抗原特性和肠毒活性的短肽,为进一步研制SEB高效抑制剂奠定了基础.

金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究

目的 :探讨金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )L型肠毒素B的产生量及其基因存在情况。方法 :将金葡菌诱导成稳定L型后 ,用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素B(SEB) ,用PCR法检测SEB基因。结果 :金葡菌L型SEB的产生量与原菌比差别无显著性 (P >0 .0 5 ) ,PCR发现 4 78bp的阳性条带。结论 :金葡菌变异为L型后SEB产生量不变 ,其基因也未丢失。

抗B型葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的研制及其鉴定

本文用纯化B型葡萄球菌肠毒素(SEB)免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,经筛选及克隆化共获6株能稳定分泌抗SEB的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。通过将以混合佐剂(降植烷+FIA的混合物)和杂交瘤细胞同时注射制备McAb腹水的方法与常规法相比较,不仅量多(多1.56～1.84倍),而且活性好(高1个数量级)。初步鉴定表明:6株McAb均属IgGl亚类;其培养上清和腹水的ELISA滴度分别为10^(-3)～10^(-4)和10^(-5)～10^(-8)。它们与SEA均不起反应,其中3株(Sl.B4和E7)与SECl有轻微交叉反应;都能被10μg/m的SEB完全阻断等。说明其免疫学活性及特异性均较良好。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的:金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一,针对进出口食品卫生监测的需要,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法:利用聚合酶链反应技术(PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对,来判断阴阳性结果。结果:本方法检出率高,每克样品中有有4个金黄色葡萄球菌即可检出, 24h即可报告结果。结论:PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确,检测周期短,既可提高检出率,又可节省检测时间。

利用表面等离子体谐振技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素B

本文研究了利用自行研制开发的表面等离子体谐振 (SPR - 2 0 0 0 )生化分析仪检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)与其羊单克隆抗体IgG的免疫吸附反应 ,并研究了用SPR技术检测生物大分子相互识别反应相关的一些问题。为了消除溶液间本体折射率差异的影响 ,我们采用牛血清白蛋白 (BSA)本体折射率补偿法 ,使通入流动系统的不同溶液获得基本一样的本体折射率 ,获得了很好的效果。在此基础上 ,SPR - 2 0 0 0生化分析仪初步实验已经能检测到的SEB最低浓度是 1μg/ml,相当于 3 5× 10 -8M。进一步的实验仍在进行中。

金黄色葡萄球菌肠毒素B在变态反应性疾病发病机制中的作用

变态反应性疾病的发病率逐年上升,Ⅰ型超敏反应是其主要的发病机制。近年来研究发现,金黄色葡萄球菌肠毒素B不但可以作为变应原诱导变态反应性疾病的发生,而且还可以作为超抗原影响免疫调节细胞和促炎细胞活性,在变态反应性疾病中发挥极其重要的作用。本文对金黄色葡萄球菌肠毒素B在变应性鼻炎、哮喘及特应性皮炎几种常见变态反应性疾病发生、发展中的作用机制作一综述。

产B型肠毒素金黄色葡萄球菌及其L型某些致病物质的比较

目的 :比较产B型肠毒素金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )及其L型的某些致病物质。方法 :检测金葡菌L型产生血浆凝固酶、耐热核酸酶及肠毒素B的情况 ,并与原菌进行比较。结果 :金葡菌L型使血浆延迟至 2 4h发生凝固 ,耐热核酸酶的透明环减小 ,肠毒素B的光密度 (OD)值未见明显减少。结论 :金葡菌L型仍能产生致病物质 。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达、纯化及鉴定

为高效获取金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)用于SEB的快速检测,通过原核表达方法表达SEB,对其纯化方法进行研究,并通过Western-blot和制备的SEB纳米磁性免疫层析快速检测试纸条检测其抗原性。研究表明:SEB成功克隆入原核表达载体pET22b(+),并在E.coil BL21(DE3)中得到有效表达,表达量达65.8%;采用Ni柱亲和层析和DEAE阴离子层析两步纯化得到纯度为95.2%的SEB,Western-blot和SEB免疫层析快速检测试纸条检测显示所纯化的重组SEB具有SEB的抗原性,可用于SEB快速检测试纸的应用研究。