葡萄球菌A型肠毒素检测竞争ELISA方法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测食品中金黄色葡萄球菌A型肠毒素的方法,应用构建的pGEX-6P-SEA、pET28α-SEA重组质粒表达带有不同融合肽的葡萄球菌A型肠毒素,分别通过谷胱甘肽亲和纯化、镍螯合纯化获得SEA的重组融合表达蛋白HIS-SEA、GST-SEA,以HIS-SEA为包被抗原,以GST-SEA、天然SEA肠毒素为竞争抗原,确立了SEA型肠毒素ELISA检测的工作条件:包被浓度为2.5μg/mL,阳性血清稀释度为1∶50,辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡免疫球蛋白工作浓度为1∶2000。建立了以重组肠毒素GST-SEA作为竞争抗原检测葡萄球菌肠毒素SEA的间接竞争ELISA(ciELISA)方法,竞争肠毒素GST-SEA蛋白浓度x与P/N值y的关系式:x(GST-SEA)=1.99-y/0.34,R2(GST-SEA)=0.9964,线性检测范围均为1～62.5ng/mL,最低检测量为1ng/mL,此方法丰富了食品中A型肠毒素的检测手段。

葡萄球菌A型肠毒素的高效表达和分离纯化

根据已知葡萄球菌A型肠毒素 (SEA)的基因序列 ,用PCR从产毒标准株S .aureusFRI 10 0中扩增得到约70 0的SEA基因片段 ,并将该片段克隆至表达载体 pBV2 2 0中 ,实现了高效表达。表达产物以可溶性形式存在 ,表达的毒素用CM SephroseFF离子交换层析进行纯化 ,获得了高纯度的重组SEA ,SDS PAGE显示单一条带。ELISA试验证明所获重组SEA具有与天然SEA相似的免疫学性质。

金黄色葡萄球菌A型肠毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的金黄色葡萄球菌A型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)检测方法。【方法】以原核表达的可溶性重组SEA蛋白为免疫原,获得特异性强、亲和力高的单克隆抗体作为捕获抗体,同时制备抗SEA兔多抗血清作为检测抗体建立双抗体夹心ELISA(Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法。【结果】该方法对SEA的线性检测区间为2-128μg/L(y=1.102x-0.07,R2=0.994),检测下限为1.89μg/L,与SEB、SEC2和SED之间无交叉反应;鲜奶SEA人工污染试验测定回收率为94%-114%,变异系数小于10%。应用该方法对46株金黄色葡萄球菌水产品分离株和164株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌分离株的体外培养上清进行检测,阳性率分别为4.4%和50.6%,表明SEA污染普遍存在。【结论】建立的DAS-ELISA方法特异性、灵敏度和稳定性好,为检测SEA的食源性污染提供了有效手段。

产A型肠毒素金黄色葡萄球菌的筛选及其重组表达

目的分离产A型肠毒素金黄色葡萄球菌标准株,克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA),研究其生物学特征。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,亚克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达和纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得抗血清,进行重组蛋白免疫原性分析。结果成功克隆SEA全长基因,经DNA序列分析证实与GenBank收录序列具有100%的同源性。表达蛋白相对分子质量为31000,以包涵体形式存在。纯化、复性后获得有活性的rSEA蛋白,rSEA蛋白能够识别天然的SEA。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,rSEA具备抗原性,为制备单抗、诊断试剂及金黄色葡萄球菌致病机制研究奠定了基础。

金黄葡萄球菌肠毒素A诱导的免疫应答

目的研究超抗原金黄葡萄球菌A型肠毒素（SEA）在体内诱导的体液免疫反应、T淋巴细胞增殖及免疫无应答的规律和作用。方法利用重组SEA蛋白免疫小鼠，酶联免疫吸咐试验（ELISA）检测特异性抗体及其亚类水平，观察两者的产生过程及变化规律。RT—PCR反应检测免疫后小鼠脾脏内细胞因子的mRNA表达水平，ELISPOT法检测rSEA对脾细胞分泌IFN-γ能力的影响，流式细胞术检测T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达。结果BALB／c小鼠在低剂量的rSEA初次免疫后2周，即产生了高水平的特异性抗体，此时体内以体液免疫应答为主，IgG2a／IgG1〈1；而在免疫早期，Th1型细胞因子的mRNA表达水平高于Th2型，以细胞免疫应答为主。短时期内进行再次免疫后脾细胞的IFN-1分泌频率显著下降；流式细胞仪在rSEA激活的T淋巴细胞表面检测到了PD-1（programmed death-1）分子的表达，其表达量随时间及免疫次数增加。结论超抗原SEA初次免疫即能引起强大的体液免疫应答与细胞免疫应答；再次免疫引起了免疫无应答，这与PD-1介导的抑制作用增强有关。