外周血指标对鼻息肉患者黏膜中IL-5和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E阳性表达的预测价值

目的借助外周血指标预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)2型生物标志物。方法收集2020年6月~2022年5月在北京同仁医院鼻科住院的CRSwNP患者临床资料,检测外周血中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE以及CRSwNP黏膜中白细胞介素5(IL-5)和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E(Staphylococcus aureus enterotoxinimmunoglobulin E,SE-IgE)。应用受试者工作特征(ROC)曲线评估每个外周血指标对黏膜IL-5/SE-IgE阳性表达预测价值,利用Logistic回归筛选对黏膜IL-5/SE-IgE阳性有预测价值的外周血指标,构建诺模图模型。结果CRSwNP患者哮喘比例、血中Eos%、骨膜蛋白和总IgE在IL-5/SE-IgE阳性和阴性两组之间,均具有统计学差异。ROC曲线单因素分析显示血Eos%、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE对黏膜IL-5和SE-IgE阳性预测的AUC分别波动在0.655~0.784和0.721~0.802,Logistic回归确认血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE可分别作为IL-5和SE-IgE阳性的独立预测因素。构建预测CRSwNP黏膜IL-5/SE-IgE阳性的诺模图模型,一致性指数(C-index)为0.804和0.81,提示具有很好的预测准确性。结论血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE分别构建的诺模图,对CRSwNP黏膜IL-5和SE-IgE阳性表达具有很好的预测价值,可以预判CRSwNP内型和表型严重性。

医务人员鼻定植金黄色葡萄球菌的筛查和spa分型

目的 了解医务人员鼻腔金黄色葡萄球菌定植情况,以及鼻定植金黄色葡萄球菌spa类型与psmmec、pvl、qacA/B、mecA基因分布。方法 收集复旦大学附属上海市第五人民医院247名医务人员鼻拭子,采用质谱仪进行菌种鉴定。采用聚合酶链反应(PCR)检测spa类型和psm-mec、pvl、qacA/B、mecA基因。采用自动化鉴定药敏仪进行甲氧西林敏感性试验。采用高通量测序技术对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)进行分子分型。结果 医务人员鼻腔金黄色葡萄球菌定植率为23.89%(59/247),MRSA定植率为4.45%(11/247)。鼻定植金黄色葡萄球菌主要spa类型依次为t084(8/59,13.56%)、t309(5/59,8.47%)和t338(5/59,8.47%)、t034(4/59,6.78%)、t701(3/59,5.08%)。基于spa基因构建的进化树将鼻定植金黄色葡萄球菌归为3个主要进化支。MRSA分离株以ST398-t034-SCCmecⅤ型(36.36%,4/11)为主,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)分离株以t084型(16.67%,8/48)为主,MRSA和MSSA菌株spa类型分布差异有统计学意义(χ^(2)=49.843,P=0.017)。psm-mec、pvl、qacA/B、mecA基因检出率分别为3.39%(2/59)、11.86%(7/59)、6.78%(4/59)、18.64%(11/59)。psm-mec(χ^(2)=59.000,P=0.001)、pvl(χ^(2)=40.582,P<0.001)和mec A(χ^(2)=18.724,P=0.001)在不同spa类型中的分布差异有统计学意义。结论 医务人员鼻定植金黄色葡萄球菌spa类型多样,MRSA的SCCmec类型和ST类型多样,毒力基因和耐药基因在不同spa类型中存在分布差异。

金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal Protein A， SPA）分泌型融合表达系统

金黄色葡萄球菌蛋白Ａ（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＰｒｏｔｅｉｎＡ，ＳＰＡ）分泌型融合表达系统李节，邱平（南京大学生物化学系医药生物技术国家重点实验室，南京２１０００８）引言十几年前，我们制备蛋白质的方法还主要依靠从天然组织或细胞中提取，而现在人们可...

金黄色葡萄球菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系的构建

目的建立金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)巨噬细胞胞内感染状态下分泌蛋白高通量筛选体系,探索金葡菌胞内生存所需关键分泌蛋白。方法利用课题组建立的金葡菌分泌蛋白真核系统表达载体库,通过DNA转染表达技术,得到能够在细胞内表达金葡菌分泌蛋白的RAW264.7巨噬细胞阵列。金葡菌感染RAW264.7后,清除胞外菌,观察金葡菌胞内生存情况。最后通过构建相应分泌蛋白的过表达及敲除金葡菌验证筛选结果。结果通过探索RAW264.7质粒转染剂量、金葡菌感染复数(multiplicity of infection,MOI)以及感染时间,确立筛选体系的最优质粒转染剂量为1.0μg/孔、MOI为1.0、感染时间为4 h。筛选结果结合相应分泌蛋白过表达和敲除菌株验证,成功筛选出hypothetical protein、Serine protease E等分泌蛋白具有促进胞内金葡菌生存功能。结论成功构建金葡菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系。

细菌裂解蛋白SALy102对伪中间型葡萄球菌的抗菌活性分析

伪中间型葡萄球菌是犬、猫皮肤、耳道和伤口感染的主要病原菌之一,其耐药情况愈发严重且出现多重耐药性状。细菌裂解蛋白是一种新型抗菌物质。为探讨细菌裂解蛋白SALy102对伪中间型葡萄球菌的抗菌效果,本试验从皮肤或耳道感染的患犬中分离鉴定伪中间型葡萄球菌,采用比浊法测定SALy102的抗菌活性,绘制SALy102的时间-杀菌曲线;采用微量肉汤稀释法测定SALy102对伪中间型葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示,共分离鉴定出12株伪中间型葡萄球菌;SALy102对12株伪中间型葡萄球菌临床分离菌株均具有非常强的抗菌活性;时间-杀菌曲线显示,低浓度(15.63μg/mL)的SALy102也可以在1 h内快速裂解伪中间型葡萄球菌;SALy102对伪中间型葡萄球菌的MIC为32μg/mL,MBC为64μg/mL。结果表明,SALy102对伪中间型葡萄球菌抗菌作用显著,具有临床治疗犬、猫伪中间型葡萄球菌感染的潜力。

金黄色葡萄球菌Spa蛋白在不同感染类型中的差异分析

目的对临床采集的82例金黄色葡萄球菌进行DLST-spa基因扩增、测序及生物信息学分析,探讨金黄色葡萄球菌Spa蛋白在定植及感染中的异同。方法收集入院患者不同来源的标本及临床资料,经VITEK MS质谱仪鉴定进行药物敏感性测试与冻存;复苏菌株,扩增DLST-spa目的基因;运用生物信息数据库分析DLST-spa基因序列,比较不同来源标本中分离出的金黄色葡萄球菌Spa蛋白的异同,探讨Spa蛋白在定植及感染的金黄色葡萄球菌中的表达差异。结果 82株金黄色葡萄球菌菌株DLST-spa基因核苷酸主要的突变种类为A-T,G-T,A-G及C-T突变。菌株来源于静脉血、无菌体液的DLST-spa基因相较于痰、咽拭子标本存在更多突变,且在MRSA中突变频率更高;同时Spa X区蛋白长度在金黄色葡萄球菌定植或感染中存在差异,菌株来源于静脉血、无菌体液的Spa X区蛋白相较于痰、咽拭子的长度更短,且在MRSA中Spa X区蛋白长度相较于MSSA更短。结论来源于无菌体液标本感染中的金黄色葡萄球菌DLST-spa基因的突变种类和数量更多,Spa X区蛋白长度更短;相较于社区感染,来源于院内感染中分离的金黄色葡萄球菌DLST-spa基因的突变种类和数量更多,Spa X区蛋白长度更短。

葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1/SLC7A11抑制铁死亡对骨肉瘤发生发展的影响

目的探讨葡萄球菌核酸酶样结构蛋白1(SND1)对骨肉瘤细胞生物学功能的影响,及其通过SLC7A11调控骨肉瘤细胞铁死亡的作用机制。方法检测人成骨细胞hFOB1.19以及骨肉瘤细胞系Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1的表达水平。采用小干扰RNA敲减骨肉瘤细胞HOS和143B中SND1的表达(si-SND1),采用CCK8法、细胞克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验探究SND1的表达对骨肉瘤细胞生物学功能的影响;调控骨肉瘤细胞中SND1以及SLC7A11基因的表达,探究SND1通过SLC7A1基因对骨肉瘤铁死亡介导的肿瘤细胞凋亡的影响。结果骨肉瘤细胞Saos-2、U2OS、HOS和143B中SND1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于人成骨细胞hFOB1.19(P均<0.01)。与对照组比较,si-SND1转染显著降低HOS和143B细胞中SND1的表达水平(P均<0.01),且细胞活性显著降低,克隆形成数量显著减少,细胞迁移和侵袭能力显著降低(P均<0.001)。铁死亡诱导剂Erastin促进骨肉瘤HOS和143B细胞凋亡,而抑制剂Ferrostatin-1刺激上调细胞活性(P均<0.001)。敲减SND-1后使用Erastin可进一步降低骨肉瘤HOS和143B细胞活性,而使用Ferrostatin-1刺激后可显著恢复细胞活性(P均<0.001);Erastin处理后,si-SND1组细胞中铁离子和丙二醛表达增高,谷胱甘肽表达降低(P均<0.001)。体内实验结果显示,敲减SND1可以明显抑制143B裸鼠移植瘤的瘤体质量(P<0.001)。敲减SND1后骨肉瘤HOS和143B细胞中SLC7A11的表达水平显著减少(P均<0.001),且铁死亡水平升高(P<0.001,P=0.020)。结论骨肉瘤细胞中SND1表达显著增高,其可能通过上调SLC7A11的表达抑制铁死亡,进而促进骨肉瘤细胞活性。

金黄色葡萄球菌临床分离株spa分型和耐药特征研究

目的研究临床分离金葡菌的耐药性和分子特征。方法对2011年5—11月在成都某医院分离的56株金葡菌进行抗菌药物敏感性检测,检测菌株携带mecA基因和pvl基因情况,并进行spa基因分型分析。结果 56株金葡菌中,共检出耐甲氧西林金葡菌(MRSA)21株(37.5%),其中mecA基因阳性20株(95.2%);甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)35株(62.5%)。与MSSA相比,MRSA对利福平、左氧氟沙星、莫西沙星、环丙沙星、庆大霉素和四环素的敏感率显著降低(P<0.05),MRSA对万古霉素、利奈唑胺、替加环素、喹奴普丁-达福普汀和呋喃妥因全部敏感。MRSA分为6个spa型别,以t030(66.7%)为主,MRSA-t030、MRSA-t002具有突出的多药耐药特征。MSSA共分为18个spa型别,以t189、t377和t034列前3位,分别占14.3%、14.3%和11.4%,并在脓液标本检出1株新spa基因型new1。检出5株杀白细胞毒素(PVL)阳性菌株,其中3株为MSSA-t189。结论 t030是医院MRSA临床分离株中的spa优势型别,具有突出的多药耐药特征,在医院内广泛传播。MSSA遗传多样性高,以t189、t377和t034列前3位。

医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Spa和SCCmec分型研究

目的对医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)A蛋白(Spa)和葡萄球菌mec基因盒(SCCmec)分型同源性研究,为预防和控制医院感染提供依据。方法采用药敏纸片法(K-B法)、SCCmec分型及Spa分型技术,收集自2013年8月至2014年4月80株HA-MRSA,进行药敏试验和同源性分析,并检测毒力基因杀白细胞毒素(pvl)基因和毒性休克综合征(tsst)基因。结果药敏结果显示,80株HA-MRSA对青霉素、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南均耐药,对环丙沙星耐药率为90.0%,对克林霉素耐药率为58.8%,对复方磺胺类耐药率为13.8%,对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁均敏感。SCCmec分型结果显示,80株MRSA中SCCmecⅡ型占73.75%、SCCmecⅢ型(13.75%)、SCCmecⅤ型(12.5%)。Spa分型,28株为t2460型(35%)、9株为t002型(11%)、6株为t030型(8%)、7株为t632型(9%)、5株为t037型(6%),其他Spa型相对分散。pvl基因阳性率为7.5%(6株),tsst基因为阴性。结论 HA-MRSA SCCmec分型以Ⅱ为主,Spa分型以t2460型为主,有较高的同源性;HA-MRSA对多种药物具有较高的耐药性并且存在多重耐药。

牛源金黄色葡萄球菌spa基因多态性分型研究

目的为了研究引起奶牛乳房炎的主要病原菌金黄色葡萄球菌的35个分离株进行spa基因多态性分型研究。方法在河北、内蒙古、山东、黑龙江、湖北、河南等省份采集奶牛乳房炎奶样,经实验室分离鉴定,从中择35株金黄色葡萄球菌,采用PCR方法扩增spa基因的X区域,测序后根据数据库(http://www.ridom.de/spaserver/)进行分型。结果35株菌可分成11个型,分别为t521型有8株,t518型和t2788型各5株,t246型和t519型各4株,t359型和t2756型各3株,t189型t、224型t、267型t、2759型各有1株;同时发现3个新型,分别为t2788、t2756t、2759。结论研究显示spa基因分型方法具有快速、分辨力强、易于标准化等特点,可用于牛源金黄色葡萄球菌的基因分型及生态学等研究。

葡萄球菌A蛋白(SPA)的制备研究

经培养金黄色葡萄球菌1.800菌株,采用酶消化法分离葡萄球菌A蛋白(SPA),经饱和硫酸铵盐析、SephadexG-200柱层析提取SPA。提取的SPA经环状沉淀试验,琼脂扩散试验,间接ELISA试验定性判定确认从金黄色葡萄球菌1.800里提取的是SPA,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度达到了电泳纯。紫外分光光度计测其蛋白含量为17.82mg/ml。提取的SPA可广泛应用于免疫学中。

重组溶葡萄球菌蛋白的原核表达、纯化及生物学活性研究

目的原核表达重组溶葡萄球菌蛋白并检测其杀菌效力。方法在成熟溶葡萄球菌蛋白编码序列的基础上,设计重组序列,采用PCR技术扩增,克隆至大肠埃希菌表达载体,IPTG诱导表达,用微量稀释法研究其对金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)的杀菌效果。结果目的DNA片段克隆至表达载体后经测序鉴定正确,在大肠埃希菌中获得高效表达,经免疫印迹鉴定重组蛋白表达正确。重组溶葡萄球菌蛋白对金葡菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)均小于传统抗生素。结论成功表达重组溶葡萄球菌蛋白,其对金葡菌有强大的杀菌效力。

葡萄球菌A蛋白协同凝集试验快速检测草鱼出血病病毒

本文报道葡萄球菌 A蛋白协同凝集(SPA COA)快速检测草鱼出血病病毒的方法以及对提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织检测的初步结果。并对该方法进行了特异性和敏感性考核以及凝集物的电镜观察。该方法快速、特异、设备简单,适合基层单位检测草鱼出血病病毒,并有可能作为草鱼出血病疫苗质量鉴定的指标之一。

葡萄球菌蛋白A活性机制与现代应用

葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A,SPA)是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁上的一种黏连蛋白。经过几十年的研究,由于其对免疫球蛋白IgG的亲和特性,SPA已作为一种工具在抗体的检测、纯化以及疾病诊断中得到了广泛应用。SPA衍生物的构建适应了现代生产的需要,改造后的SPA可以与多种报告分子相偶联,使得免疫诊断更加快速准确。本文综述了SPA基于其免疫学特性,在抗体纯化和现代免疫分析应用中的发展状况及前景。

进出口食品中金黄色葡萄球菌spa基因的分型

目的对我国进出口食品中分离得到的金黄色葡萄球菌进行spa基因分型。方法对36株金黄色葡萄球菌的spa基因进行PCR扩增,并对产物进行测序分析,测序结果通过数据库进行spa基因分型。结果共分出16个基因型,分别为t189、t091、t164、t002、t899、t197、t1044、t034、t156、t7400、t2592、t4209、t127、t437和两株新发现的基因型。其中t189型共有13株,t091型共4株,t164和t002型分别为3株,其余型分别为1株。结论 食品中分离出的36株金黄色葡萄球菌spa分型以t189居多,t091型次之,其他14型相对较少。

金黄色葡萄球菌SPA基因的克隆、表达及纯化

目的:构建携带StaphylococcalproteinA(SPA)基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的SPA。方法:用PCR从金黄色葡萄球菌基因组中扩增SPA基因并克隆入pET32a(+)载体中,在大肠杆菌BL21〈DE3〉中表达。表达产物经亲和层析进行纯化。结果:所构建的原核表达载体为高效表达载体,工程菌表达的SPA约占菌体总蛋白的40%,经亲和层析纯化后获得SPA,纯度达到99%。结论:成功地建立了制备及纯化SPA的方法,为SPA大量生产以及构建SPA融合表达体系奠定了基础。

腐生葡萄球菌S25对四川香肠自然晾挂成熟过程中脂肪和蛋白质的影响

将腐生葡萄球菌S25接种到四川香肠中进行自然发酵,同时以不接菌的自然成熟香肠为对照,测定两组香肠自然成熟过程中脂肪和蛋白质含量的变化。结果显示:接种组的酸价在后期高于对照组;在自然晾挂成熟第15天和第30天,接种组的不饱和脂肪酸在总脂肪中含量分别为74.34%和74.30%,并且都高于对照组;在自然晾挂成熟过程中,接种组的总氮和非蛋白氮含量都高于对照组;在自然晾挂成熟第15天,接种组的游离氨基酸总量比对照组提高了19%,鲜味氨基酸(Glu)提高了31%,甜味氨基酸(Gly)提高了10%,必需氨基酸总量提高了21%;在自然晾挂成熟第30天,接种组的游离氨基酸、鲜味氨基酸、甜味氨基酸和必需氨基酸含量略高于对照组。结果表明,腐生葡萄球菌S25对四川香肠自然晾挂成熟过程中脂肪和蛋白质的分解有明显促进作用。

木糖葡萄球菌对风鸭蛋白质降解的影响

以木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)为发酵剂加工风鸭,研究其在风鸭加工过程中对肌肉蛋白降解的影响。用SDS-PAGE电泳分析蛋白质的降解规律,同时比较加工初期及末期游离氨基酸的变化,并以不接菌样品为对照。结果表明:与对照相比,木糖葡萄球菌促进了肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的降解,显著增加了游离氨基酸的总量;产鲜氨基酸的总量和比例均显著增加;必需氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸总量显著增加,比例显著下降。总之,木糖葡萄球菌是一种优良的发酵剂。

金黄色葡萄球菌重组GapC蛋白的GAPDH活性及免疫原性分析

为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表面GapC蛋白的GAPDH活性、免疫原性及免疫保护作用,应用PCR方法扩增出S.aureus的gapC基因,插入到pQE-30载体相应位点,构建重组质粒pQE/gapC。将其导入宿主菌E.coliM15(pREP4)后,IPTG诱导表达。重组蛋白纯化后进行GAPDH活性检测,并与灭活全菌体分别免疫健康家兔。然后,应用ELISA方法检测血清中IgG抗体水平及IFN-γ、IL-4细胞因子浓度,并用1.0×108CFU/mLS.aureus菌株Wood46对免疫家兔攻毒。SDS-PAGE结果显示,GapC蛋白在E.coliM15(pREP4)中获得表达;经GAPDH活性检测及WesternBlot检测,重组蛋白具有较高的GAPDH活性和抗原特异性;经ELISA检测,GapC蛋白及全菌体组兔血清中IgG抗体水平迅速升高,并在加强免疫后第28天达到最高(1:64000),加强免疫后第14d,血清中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度与对照组相比,显著升高(P<0.05),而全菌体免疫组升高不明显(P>0.05);攻毒结果为蛋白免疫组家兔获得一定的免疫保护(4/5)。以上结果表明,表达的重组GapC蛋白具有GAPDH活性、较好的免疫原性及免疫保护力,可作为深入研究S.aureus基因工程疫苗的良好靶向。

金黄色葡萄球菌表面蛋白研究进展

金黄色葡萄球菌是一种常见的人兽共患病的病原菌。通过其表面蛋白(黏附素)与宿主的细胞外基质结合感染宿主,这些蛋白的结构已从分子水平上得到揭示。本文综述了金葡菌产生的表面蛋白及其主要蛋白的分子结构。