原核表达的葡萄球菌D型肠毒素超抗原的纯化及其促淋巴细胞增殖作用

目的 纯化原核表达的葡萄球菌D型肠毒素 (StaphylococcalenterotoxinD ,SED) ,检测其促淋巴细胞增殖活性 ,为SED免疫识别研究奠定基础。方法 用Ni2 + NTA金属螯合亲和层析法纯化 6×His SED融合蛋白 ,SDS PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度 ,BCA法进行定量 ,以3H TdR掺入法检测纯化的SED对人和小鼠淋巴细胞的促增殖活性。结果 获得可满足后续功能实验纯度较高的蛋白质 ;SED对人淋巴细胞的促增殖作用呈质量浓度依赖关系 ,0 .1μg mL时 ,细胞增殖最明显 ;淋巴细胞的增殖与IL 2分泌水平呈正相关。

葡萄球菌D型肠毒素超抗原TCR Vβ结合位点的研究

目的 :研究金黄色葡萄球菌D型肠毒素 (SED)超抗原与TCRVβ结合的关键位点。 方法 :利用定点突变技术 ,构建了 6种SED的突变体。用3 H TdR掺入法检测这些突变体促进T细胞增殖的活性。对促增殖活性降低的突变体 ,进一步用流式细胞仪检测他们与MHC Ⅱ类分子结合的活性和其TCRVβ特异性。结果 :发现N2 3位氨基酸是SED与人TCRVβ5结合的关键位点。H2 6位氨基酸可能是SED与人的其他TCRVβ(除TCRVβ5、TCRVβ8和TCRVβ12 .1)结合的关键位点 ,值得进一步研究。结论 :本结果丰富了对超抗原免疫识别的认识 ,为葡萄球菌超抗原相关疾病的防治 。

超抗原SED在大肠杆菌中的表达

目的构建稳定的SED原核表达系统。方法采用PC R技术扩增葡萄球 菌D型肠毒素（SED）超抗原的成熟蛋白编码区DNA序列，构建SED DNA与6个组氨酸基因融合的表达载体pTrcHis-SED，转入E.coli DH5α，IPTG诱导后，用SDS-PAGE和免疫印迹 检测融合蛋白的表达情况。目的蛋白用Ni-NTA金属亲和层析法进行纯化，SDS-PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度。结果成功构建了原核表达载体pTrcHis-SED。分子量 约 为28 000 u的6His-SED融合蛋白可在E.coli DH5α中稳定表达。Ni-NTA金属亲和层析 后得到 纯度较高（>95%）的SED融合蛋白，且具有免疫学活性。结论本研究为SE D免疫识别研究奠定了实验基础。