烟酰胺单核苷酸对低血糖后葡萄糖再灌注大鼠学习记忆的影响

目的探讨研究烟酰胺单核苷酸对低血糖后葡萄糖再灌注大鼠学习记忆能力的影响及其保护作用机制。方法将30只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组,10只)、低血糖后葡萄糖再灌注组(GR组,10只)及低血糖后葡萄糖再灌注并给予烟酰胺单核苷酸治疗组(GR+NMN组,10只)。采用Morris水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力的变化,免疫荧光方法检测海马组织内NAD^+水平,用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)来检测海马组织内活性氧(ROS)聚集情况。结果与Sham组比较,GR组逃避潜伏期均显著延长,原平台象限活动时间显著减少,穿越平台次数显著减少,海马组织内NAD^+水平显著降低,海马组织内ROS的水平也显著升高(均P<0.05)。与GR组比较,GR+NMN组,逃避潜伏期均显著缩短;原平台象限活动时间显著增加,穿越平台次数显著增多,海马组织内NAD^+水平显著升高,海马组织内ROS的水平也显著降低(均P<0.05)。结论烟酰胺单核苷酸可显著提高低血糖后葡萄糖再灌注大鼠的学习记忆能力,其作用机制可能与减轻海马组织氧化应激及增加海马组织内NAD^+的水平有关。

低血糖后葡萄糖再灌注大鼠海马Nogo-A蛋白的表达

目的探讨胰岛素诱导大鼠低血糖后葡萄糖再灌注对大鼠海马Nogo-A蛋白表达的影响。方法41只4个月龄雄性Wistar大鼠随机分为3组:假手术组(Sham)、低血糖组(HG)、低血糖后葡萄糖再灌注组(HG/GR)。采用DAPI染色观察大鼠海马神经元的凋亡、坏死变化;免疫组织化学染色和Western免疫印迹检测大鼠海马Nogo-A蛋白的表达变化。结果①Nogo-A免疫组化染色:Nogo-A表达量Sham大于HG和HG/GR,三组之间比较,P<0.05;②Western免疫印迹:Nogo-A的表达量,Sham最大,HG次之,HG/GR最小,三组之间差异有统计学意义P<0.01,HG和HG/GR两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论低血糖后再灌注葡萄糖,大鼠海马神经元坏死及凋亡程度增加,Nogo-A蛋白表达降低。

罗格列酮对大鼠局灶性脑缺血葡萄糖再灌注性损伤的影响

目的探讨血糖水平和胰岛素反应状态在局灶性脑缺血大鼠再灌注性脑损伤中的作用。方法将雄性SD大鼠随机分为局灶性脑缺血/再灌注模型生理盐水对照组、罗格列酮(RSG)高、中、低剂量预处理组(4、2、1 mg·kg^(-1)·d^(-1))、假手术组,每组8只。线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞2 h再灌注22 h模型(MCAO)。测定空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血压、血清胰岛素水平,计算胰岛素敏感指数(IAI)。观察RSG对大鼠脑梗死体积和神经功能评分的影响。结果 IAI与梗死体积和神经功能评分存在相关性。与生理盐水对照组比较,RSG各剂量组脑梗死体积显著缩小,神经功能评分显著改善(P<0.05或P<0.01),胰岛素敏感性显著增高(P<0.05或P<0.01),脑缺血后高血糖显著减轻(P<0.05),并呈剂量依赖性。结论高血糖和胰岛素抵抗共同作用加重局灶性脑缺血葡萄糖再灌注性脑损伤,且胰岛素抵抗更持久;RSG对脑缺血葡萄糖再灌注性脑损伤的神经保护,单纯降低血糖是不够的,改善胰岛素抵抗更重要。

低血糖后葡萄糖再灌注脑损伤相关机制及预防

糖尿病发病率越来越高,已成为全球性问题,随着强化控糖观念的提出及胰岛素的广泛应用,糖尿病相关的低血糖发生率也逐渐增加。持续低血糖会导致各种急性心脑血管疾病,然而新近研究发现胰岛素诱导低血糖后,给予葡萄糖升高血糖后出现了比低血糖状态时更严重的心脑血管损害,尤其是对脑的损伤尤为显著,类似于缺血再灌注,因此人们提出“葡萄糖再灌注损伤”的概念。目前关于葡萄糖再灌注性脑损伤的机制尚不清楚,考虑与氧化应激、自噬、钙离子超载、钙蛋白酶的激活、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1等有关。

葡萄糖再灌注对2型糖尿病并发低血糖患者影响的研究

目的观察2型糖尿病患者（DM）并发低血糖后血糖升高至不同水平时生化指标的变化,探讨葡萄糖再灌注对2型糖尿病并发低血糖患者的影响及其影响机制。方法将2012年10月~2014年10月收治的60例2型糖尿病并发中至重度低血糖患者通过随机数字表随机分为A、B组,各30例,两组指尖血糖分别升高至6~8 mmol/L及9~12 mmol/L;选同期随机指尖血糖在6~12 mmol/L 2糖尿病患者35例为对照组（C组）,各组间年龄、ALT、AST、BUN、Cr差异无统计学意义,A、B两组基线血糖、CK、CK-MB、Cys C、CRP差异无统计学意义。比较A、B组升糖前后及C组生化指标和CRP的变化。结果 A组升糖后的CK、CK-MB较升糖前显著降低（p〈0.05）,B组升糖后CK、CK-MB较A组升糖后显著升高（p〈0.05）;C组CK、CK-MB较A、B组升糖前显著降低（p〈0.05）;A组升糖后的Cys C、CRP较升糖前差异无显著性（p〉0.05）,B组升糖后的Cys C、CRP较升糖前及A组升糖后显著性升高（p〈0.05）;C组Cys C、CRP较B组升糖后显著下降（p〈0.05）,三组总体CRP与血糖（r=0.395,p〈0.01）、Cys C（r=0.365,p〈0.01）呈正相关。结论 2型糖尿病并发低血糖患者葡萄糖升至较高水平时不利于心肌损伤修复,并引起早期肾损害,提示存在葡萄糖再灌注损伤;炎症因子CRP与葡萄糖再灌注损伤相关。

辣椒素对氧葡萄糖剥夺/再灌注所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制研究

目的:研究辣椒素(CAP)对氧葡萄糖剥夺/再灌注(Oxygen-glucosedeprivation/reperfusion,OGD/R)所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及可能机制。方法:将SH-SY5Y细胞随机分为6组:正常组,模型组,尼莫地平组(5μg/mL)和CAP低、中、高剂量组(1、5、25μmol/L)。正常组细胞不进行OGD/R干预,一直在正常条件下培养,其余各组细胞通过OGD/R建立细胞损伤模型。在整个OGD/R过程中,分别给予尼莫地平组和CAP低、中、高剂量组相应剂量的药物。OGD/R 24 h后,分别检测各组细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)水平、Caspase-3和Caspase-9活性、Bcl-2和BaxmRNA的表达,同时采用网络药理学方法探讨CAP治疗缺血性卒中的潜在作用机制,并进行实验验证。结果:与正常组相比,OGD/R导致SH-SY5Y细胞活力降低,Bcl-2 mRNA表达降低,LDH、Caspase-3和Caspase-9活性升高,BaxmRNA的表达增高(P<0.01)。CAP则能明显增强OGD/R作用下SH-SY5Y细胞活力,降低LDH、Caspase-3和Caspase-9活性,提高Bcl-2 mRNA表达,降低BaxmRNA的表达(P<0.01)。通过网络药理学方法共获得CAP抗缺血性卒中的相关基因59个,经KEGG富集分析发现,PI3K/Akt信号通路富集最显著。实验验证发现,抑制PI3K可显著降低CAP的保护作用,同时与正常组相比,CAP中、高剂量组可显著增加PI3K、AktmRNA表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:CAP能减轻OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤,减少细胞凋亡,这可能与激活PI3K信号通路有关。CAP可能是一种有前途的治疗缺血性卒中的化合物。

TRAF5通过调控IL-17A/NF-κB信号通路减轻氧-糖剥夺/再灌注引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡

目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子5(tumor necrosis factor receptor-associated factor 5,TRAF5)对氧-葡萄糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡的影响及相关分子机制。方法 体外培养大鼠心肌细胞系H9c2细胞,构建OGD/R诱导的H9c2细胞模型,以脂质体转染法将TRAF5过表达质粒(pcDNA-TRAF5)和空载质粒(pcDNA-NC)转染至OGD/R诱导的H9c2细胞。采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测细胞中TRAF5基因表达,CCK-8法测定细胞活力,试剂盒法检测细胞中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和炎性因子水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达。结果 与对照组比较,OGD/R组H9c2细胞中TRAF5 mRNA和蛋白表达量降低,细胞活力降低,细胞中LDH、cTnT、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)浓度升高,细胞凋亡率升高,细胞中B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达量降低,Bcl-2相关蛋白(B-cell-lymphoma-2 related protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme-3,cleaved caspase-3)、白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)蛋白表达量及磷酸化核转录因子-κB(phosphorylated nuclear factor-κB,p-NF-κB)/NF-κB比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与OGD/R组比较,OGD/R+pcDNA-TRAF5组H9c2细胞中TRAF5 mRNA和蛋白表达量升高,细胞活力升高,细胞中LDH、c TnT、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1浓度降低,细胞凋亡率降低,细胞中Bcl-2蛋白表达量升高,Bax、cleaved caspase-3、IL-17A蛋白表达量及p-NF-κB/NF-κB比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TRAF5可减轻OGD/R引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡,其作用机制可能与调控IL-17A/NF-κB信号通路有关。

微小RNA-199a-5p调控Klotho表达对体外脑缺血再灌注大鼠氧-葡萄糖剥夺/再灌注诱导的肾上腺嗜铬瘤细胞损伤的保护作用

目的探究抑制微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)表达对体外脑缺血再灌注(I/R)损伤大鼠模型氧-葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)损伤的保护作用,并进一步探讨Klotho在该过程中的作用。方法将PC12细胞分为Control组、OGD/R组、miR-NC inhibitor组、miR-199a-5p inhibitor组、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1组和miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho组。RT-qPCR或蛋白质印迹法(Western blotting)确定各组PC12细胞转染效率;胆囊收缩素/缩胆囊素八肽(CCK-8)和流式细胞术确定各组PC12细胞活力和凋亡率;试剂盒测量各组PC12细胞中活性氧(ROS)释放量、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组PC12细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-6(IL-6)水平;双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p与Klotho靶向关系。结果在OGD/R诱导的PC12细胞中,miR-199a-5p表达增高,Klotho表达降低;细胞活力降低,凋亡率增高;ROS释放量和MDA含量以及TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平升高,SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)。转染miR-199a-5p抑制物减弱了OGD/R的诱导PC12细胞活力下降和细胞凋亡率增高;削弱了暴露于OGD/R的PC12细胞中ROS释放量和MDA含量以及TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平,并提高了SOD与GSH-Px活性(P<0.05),而miR-199a-5p抑制物对OGD/R诱导PC12细胞的这些作用可被敲低的Klotho逆转(P<0.05)。另外,miR-199a-5p负靶向调控Klotho表达(P<0.05)。结论抑制miR-199a-5p通过靶向Klotho减轻氧化应激和炎症反应来改善OGD/R诱导的PC12细胞损伤。

低血糖脑损害及后续效应

低血糖即血浆葡萄糖水平低于生理范围的状态,也是内科急症之一。原因包括药物、肝肾功能衰竭、升糖激素缺乏,葡萄糖摄入不足、内源性高胰岛素、重症感染等。临床上大部分低血糖发生在糖尿病人群中,尤其是使用胰岛素的糖尿病患者。对于非糖尿病患者,低血糖的诊断标准为血糖〈2.8 mmol/L,正在接受药物治疗的糖尿病患者血糖≤3.9 mmol/L即属于低血糖范畴。