含三倍体葡萄糖反应元件的质粒的构建及序列分析

用酚氯仿抽提法提取SD大鼠肝脏的基因组DNA,PCR扩增单倍体葡萄糖反应元件(glre)。分别用SacⅠ酶单酶切glre、pUC118载体后,连接、转化,PCR筛选出含三倍体glre的质粒并测序。结果PCR扩增出51bp的目的DNA片段,与文献报道的葡萄糖反应元件glre的大小一致;连接转化后,经PCR筛选出三倍体glre,序列分析显示其基因序列和Genbank数据库中的glre基因一致。以上结果表明构建成功含三倍体glre的质粒,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。

葡萄糖调控的胰岛素原真核表达载体的构建

【目的】构建胰岛素原真核表达载体,在肝细胞内实现葡萄糖调控下的成熟胰岛素的表达。【方法】(1)RT-PCR方法从胎儿胰腺获取野生型人胰岛素原cDNA;(2)重叠延伸PCR法在人胰岛素原cDNA上制造两个点突变,该胰岛素原cDNA片段命名为胰岛素/furin(INS/furin);(3)将INS/furin亚克隆至含葡萄糖反应元件(GlRE)的p(GlRE)3BP-1Luc的多克隆位点上。【结果】HindⅢ和EcoRV酶切及测序均证实载体p(GlRE)3BP-11×furin构建成功。【结论】含葡萄糖反应元件的点突变胰岛素原基因真核表达载体p(GlRE)3BP-11×furin有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体之一。

重组人胰岛素基因在大鼠肝癌细胞中的调节表达

目的:探讨转染含有葡萄糖反应元件(GLRE)的重组人胰岛素基因大鼠肝癌细胞中不同葡萄糖浓度下胰岛素的分泌情况。方法:利用含有重组质粒[PLXSN-(GLRE)3-BP-1MpINS]的逆转录病毒转染大鼠肝癌CBRH7919细胞,筛选出阳性细胞克隆,调整葡萄糖浓度,测定培养液中胰岛素值。结果:转染后38 h,葡萄糖浓度为0,5,15,25 mmol/L,胰岛素分泌量分别为(5.03±0.72),(9.57±0.49),(32.60±1.96),(43.90±2.30)IU/L,各组间差别显著(P<0.05);转染后1个月,在上述葡萄糖浓度下,胰岛素分泌量分别为(3.57±0.21),(5.30±0.20),(16.27±0.87),(23.23±1.12)IU/L,各组间差别显著(P<0.05)。结论:构建的重组人胰岛素基因具有随培养液中葡萄糖浓度升高调节胰岛素分泌的能力。