生物转化法合成葡萄糖基抗坏血酸的产酶菌株筛选及发酵条件优化

从土壤中筛选到1株产α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20,α-glucosidase)的菌株WPD2,通过对其进行形态学和18S rDNA序列分析及系统发育研究,该菌株初步鉴定为黑曲霉(Aspergillus nigerEU366904),该菌经产酶、转化反应后葡萄糖基抗坏血酸产量达到370 mg/L左右。摇瓶实验确定了优化后的产酶条件为:培养温度34℃,培养时间60 h,以110 g/L的麦芽糖为碳源、10 g/L的(NH4)2SO4为氮源,优化后葡萄糖基抗坏血酸产量达到410 mg/L左右。

2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸研究进展

维生素C(又称抗坏血酸)是一种水溶性维生素,对人体健康有重要作用。抗坏血酸在食品、医疗、化妆品等行业上有广泛的应用价值,但由于自身的不稳定性,易被氧化降解,严重影响其应用。为解决这个问题,对稳定的抗坏血酸衍生物的研究成为国内外专家学者的研究热点。抗坏血酸的一种重要衍生物——2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G),作为抗坏血酸的替代品,稳定性显著提高,具有很好的开发应用价值。国内外针对该物质进行了诸多的研究,本文就AA-2G生物合成和应用的国内外最新研究进展进行总结概括。

2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的酶法合成及其应用研究进展

2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(2-O-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G)不仅稳定性强且保留了L-抗坏血酸(L-ascorbic acid,L-AA)的大部分生理活性,是L-AA最好的替代品。体外酶法合成AA-2G具有经济、快速、绿色和安全等显著优势,是规模化生产AA-2G的可行方法。该文综述体外酶法合成AA-2G的研究进展,重点梳理环糊精糖基转移酶和蔗糖磷酸化酶合成AA-2G的研究现状,并对AA-2G的功能及应用前景进行讨论和展望。

环糊精葡萄糖基转移酶的酿酒酵母表面展示及其生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸

【目的】将环状芽孢杆菌251(Bacillus circulans 251)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase,CGTase)展示在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞表面,构建全细胞催化剂生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G),以提高AA-2G的产量。【方法】将CGTase编码基因cgt连接到载体质粒p YD1中的a凝集素(a-agglutinin)Aga2p亚基基因的下游构建表面展示重组质粒p YD1-cgt,转化酿酒酵母EBY100获得重组菌EBY100-p YD1-cgt,对发酵条件(培养基、诱导温度和诱导剂半乳糖浓度)进行优化;同时先后对重组菌的发酵产酶以及表面展示CGTase的酶促合成AA-2G的条件进行了优化;进一步又比较了表面展示的CGTase与E.coli BL21发酵所得的游离CGTase在酶促制备AA-2G过程中副产物的积累情况。【结果】展示CGTase的酿酒酵母重组菌株以YPG培养基作为发酵培养基,诱导剂半乳糖初始添加浓度为20 g/L,经25℃诱导48 h后,表面展示CGTase最大酶产量为0.5 U/m L;表面展示CGTase 40℃条件下的温度稳定性比游离酶有所提高,p H稳定范围变宽。对表面展示的CGTase制备AA-2G转化条件的优化发现,其最适温度最适p H分别为30℃和4.5,转化48 h达到平衡,表面展示的CGTase制备AA-2G的产量较游离酶提高了37%。【结论】对于CGTase,a凝集素系统是一个有效的展示系统,构建的酿酒酵母全细胞催化剂用于酶促制备AA-2G时,产生的副产物葡萄糖可能被酵母细胞利用,从而降低了葡萄糖与VC的竞争作用使AA-2G的产量增加,该全细胞催化剂具有良好的应用前景。

枸杞子中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸抑制黑素合成的研究

目的:研究枸杞子中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)对体外培养的B16黑素瘤细胞黑素合成的影响及作用机制。方法:不同浓度的AA-2βG作用于B16黑素瘤细胞,测定细胞的增殖率、酪氨酸酶活性和黑素含量,并以维生素C(Vc)作对照。结果:AA-2BG在浓度为2．96和4．44mmol·L^(-1)时,对B16细胞增殖抑制率可达75．99％和85．97％,对黑素合成的抑制率为32．29％和58．75％;AA-2βG对细胞生长中酪氨酸酶活性的半抑制率浓度(IC_(50))为1．84mmol·L^(-1),而Vc则为3．85mmol·L^(-1),表明AA-2βG对酪氨酸酶抑制效果优于Vc。结论:AA- 2βG具有明显的抑制细胞黑素合成作用。

新型维生素C前体2-O-α/β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的研究进展

综述2种维生素C前体2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2αG)和2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)的来源、合成、分离纯化方法及其生物活性,特别是从枸杞中分离纯化的AA-2βG为国内首次报道,并展望其在医药领域的发展前景。

HPLC法检测2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸

建立了高效液相色谱法检测维生素C衍生物2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的方法。采用Waters AtlantisT3-C18色谱柱;流动相为25 mmol/L的KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（p H 2.0）;流速为0.70 m L/min;柱温30℃;检测波长为238 nm。2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸质量浓度在0.0625~3 mg/m L范围内线性关系良好,相关系数〉0.99,回收率为100.2%,RSD为1.0%。

生物合成葡萄糖基-L-抗坏血酸产酶条件及转化条件优化

采用单因素实验确立微生物发酵法产环糊精糖基转移酶培养基基本条件和工艺条件,利用此酶催化L-抗坏血酸和糖基供体β-环糊精合成葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G),并通过正交实验考察不同加酶量、反应温度、pH等因素,确立环糊精糖基转移酶合成产物最佳条件为:在浓度0.04 mol/L L-抗坏血酸,酶量20 ml,pH值7.0,温度50℃下反应15 h。

酶法合成葡萄糖基-L-抗坏血酸的产酶条件及转化条件优化

采用单因素实验确立微生物发酵法产环糊精糖基转移酶培养基的基本条件和工艺条件,利用此酶催化L-抗坏血酸和糖基供体β-环糊精合成葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G),并通过正交实验考察不同加酶量、反应温度、pH值等因素,确立环糊精糖基转移酶合成产物的最佳条件为:浓度为0.04mol/L的L-抗坏血酸,酶量20mL,pH值7.0,温度50℃下反应15h。

新抗氧化剂2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的研究进展

新抗氧化剂2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)是源于枸杞子的生物活性物质,本文从AA-2βG的抗氧化活性、生产方法等方面综述了其研究进展。通过4种抗氧化能力测试法比较L-抗坏血酸(L-AA)及其衍生物AA-2βG、2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2αG)的抗氧化活性,发现AA-2βG比L-AA更稳定,抗氧化能力较L-AA持久温和,对机体刺激性小,可长时间存在于体内直接发挥抗氧化活性,亦能被β-葡萄糖苷酶水解,释放L-AA发挥作用。通过比较AA-2βG的生产方法,发现生物法具有步骤简单,产物更易被消费者接受等优点。

2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸酶法合成工艺优化

以L-抗坏血酸和β-环糊精为底物,利用海洋微生物Y112所产的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)催化合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)。在单因素试验的基础上应用Plackett-Burman试验设计筛选出3个对AA-2G产量有显著影响的因素(pH、底物浓度、加酶量),然后应用Box-Behnken方法进行三因素三水平的试验设计优化AA-2G酶法合成工艺。结果表明,最佳工艺条件为:加酶量90.78U/g·β-环糊精,pH 9.07,底物浓度56.81g/L,底物配比11(体积比),转化时间24h,温度45℃。该条件下,AA-2G的产量为10.62g/L。

酶法合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的研究进展

2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)是一种L-抗坏血酸衍生物,稳定性好且生理活性与L-抗坏血酸最接近,目前已广泛应用于化妆品、食品、医药等领域。介绍了酶法合成AA-2G的转化方法、条件优化和分离纯化方法,并对其发展前景进行了展望。

AA-2βG与V_c对DPPH自由基清除作用的比较

用DPPH自由基(DPPH.)清除法,比较了不同浓度、不同pH值时Vc和AA-2βG对DPPH.的清除作用.结果表明,AA-2βG与Vc对DPPH·的清除能力均与浓度呈明显量效关系;AA-2βG对DPPH·的清除作用是一个长时间的过程,且清除能力随pH值的升高而下降;在乙醇(φ=60%)-柠檬酸缓冲液(φ=40%,pH=3.0)体系中,AA-2βG对DPPH·的清除能力较Vc强.与Vc相比,AA-2βG具有较高的稳定性和较长的时效性,说明其具有与Vc相似但又不完全相同的抗氧化机制.可为AA-2βG作为稳定的Vc衍生物应用于医药、食品和化妆品等领域提供基础数据,为正确理解枸杞的组效关系,揭示枸杞抗氧化、抗衰老等药效机制提供参考.

利用环糊精糖基转移酶转化合成AA-2G的研究

利用环糊精糖基转移酶(CGT-SL)对转化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的条件进行考察。反应产物通过HPLC/LC-MS分析确定含有AA-2G。以便宜易得的可溶性淀粉和VC作为底物,在初始反应条件下AA-2G的产量为1.23 g/L。通过转化条件优化初步确定了转化反应的最优条件:最适温度15℃,最适pH 4.0,转化反应时间32 h,底物VC和可溶性淀粉的比例为2∶4,VC质量浓度为16 g/L,酶浓度为79 U/m L时,AA-2G的产量达到6.23 g/L,VC转化率为19.93%。

三种抗坏血酸糖苷的合成及其α-糖苷酶抑制活性

2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)是从枸杞中分离得到的一种天然抗坏血酸糖苷化合物,通过化学方法合成了AA-2βG及其两种类似物,并用商品化的阿卡波糖作为阳性对照,研究了三种抗坏血酸糖苷对酿酒酵母α-葡萄糖苷酶和猪胰腺α-淀粉酶的活性影响.结果显示,三种抗坏血酸糖苷对α-葡萄糖苷酶有显著的抑制作用,对α-淀粉酶抑制作用不明显,说明这三种抗坏血酸糖苷具有作为α-糖苷酶抑制剂开发的潜质.

基于酶触发的点击化学反应测定β-葡萄糖苷酶活性

建立了一种新的β-葡萄糖苷酶活性定量检测的方法,其原理是通过β-葡萄糖苷酶对2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的特异性水解,释放出抗坏血酸来还原Cu(II),原位生成的Cu(I)催化荧光较弱的香豆素和苄基叠氮进行环加成点击反应,产生高荧光强度的三氮唑,从而利用荧光光谱检测体系荧光强度的变化,反映出β-葡萄糖苷酶的活性.实验结果显示,在1～40U/L范围内,荧光强度增强程度与β-葡萄糖苷酶活性呈线性关系,可实现定量检测,其最低检测限为0.456 U/L.

枸杞子中AA-2βG防护晶状体氧化损伤的实验研究

目的研究枸杞子中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)对晶状体氧化损伤的保护作用。方法体外培养正常兔晶状体,采用H2O2氧化损伤法诱导建立晶状体混浊模型,分别于24,48,72 h培养结束后观察各组晶状体(空白对照组、H2O2氧化损伤组、维生素C组、AA-2βG组)的混浊情况,检测各组晶状体组织的总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)的含量变化。结果随时间延长,空白对照组晶状体混浊不明显,H2O2组混浊程度逐渐加重,Vc组和AA-2βG组晶状体混浊明显延迟;和H2O2组相比,Vc组和AA-2βG组SOD、GSH及T-AOC水平都有提高,MDA的含量降低。结论 AA-2βG可以延缓H2 O2诱导的兔晶状体混浊,对晶状体的氧化损伤具有保护作用。

枸杞子中AA-2βG体外抗氧化作用研究

目的:研究枸杞子中2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)的体外抗氧化作用。方法:以维生素C(Vc)为对照,通过测定AA-2βG对超氧阴离子自由基(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)的清除能力,以及对家兔红细胞溶血性、家兔血清抗活性氧能力的影响,探讨AA-2βG的体外抗氧化作用。结果:AA-2βG对H2O2的清除能力优于Vc,对·OH的清除能力与Vc相近,而对O2·-几乎不具有清除作用;对血清抗活性氧能力大于Vc,能减少红细胞溶血的发生,效果优于Vc。结论:AA-2βG是枸杞子中的一个重要抗氧化成分,可能具有与Vc相似但又不完全相同的抗氧化机制。研究结果为揭示枸杞抗氧化、抗衰老等药效机制提供了新的科学依据。