产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株选育及酶分子改造研究进展

环糊精(cyclodextrin,CD)因其内疏水外亲水的特殊结构被广泛运用,而酶法制备CD是常用方法,主要应用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)。该文对产CGT酶的菌株选育和酶分子改造这两方面进行综述,重点讨论提升酶表达量的4种异源表达常用优化策略:产酶条件优化、信号肽选择、启动子优化、密码子优化,以及定点突变、定点饱和突变、易错PCR这3种常用的酶分子改造方法对酶相关特性的影响。

环糊精葡萄糖基转移酶my20结构域删除突变体的表达和酶学性能

本实验以海洋来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)my20为研究对象,构建了D、E以及DE结构域截短突变体,通过pET-24a载体和宿主菌E.coli BL21(DE3)进行异源表达,并利用镍亲和层析柱纯化得到纯酶。以my20环化比活力为100%计,my20ΔD、my20ΔE、my20ΔDE相对环化活力分别约为197%、22%、17%,表明E结构域是CGTase催化环化反应的重要结构域,D结构域的存在可能降低了底物分子进入催化结构域的能力。my20为耐热酶,3种截短突变酶相较之下耐热性均有不同程度的降低,说明D、E结构域在CGTase耐热性方面具有重要的作用。my20在缺失了DE结构域后,催化产物中α-环糊精占比相较其他截短酶提升约8%,表明缺失DE结构域影响其产物的特异性。本实验结果可为CGTase通过结构域改造在工业生产方面发挥作用提供一定的理论基础。

Bacillus globisporus N75 6-α-葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达

6-α-葡萄糖基转移酶具有催化α-1,4-葡聚糖的外切水解和转糖基化功能,可通过转糖基活性产生非还原端连有α-1,6键的α-葡聚糖,可用于生产环交替糖及其分支衍生物和环异麦芽寡糖等新型功能糖。为了更好地将6-α-葡萄糖基转移酶应用于食品领域,该研究对来源于Bacillus globisporus N75的6-α-葡萄糖基转移酶在食品安全级菌株枯草芽孢杆菌中进行重组表达,并通过表达宿主的选择及优化发酵条件进一步提高重组蛋白产量。结果表明,宿主WHS9更有利于6-α-葡萄糖基转移酶的重组表达,在20℃的发酵条件下,胞内外可溶性总酶活力可达2.11 U/mL;在25℃添加20 mmol/L海藻糖发酵48 h后,总酶活力可达到2.21 U/mL;优化发酵时间后,发酵36 h总酶活力可达3.14 U/mL,是优化前WHS9表达酶活力的196倍。该研究首次实现了6-α-葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达。

葡萄糖基转移酶的结构、功能及应用研究进展

淀粉的消化性能与机体的健康相关,而酶法改性可显著提升淀粉的抗消化性能,促进机体健康。葡萄糖基转移酶作为近些年被发现的酶类,具有改性淀粉的能力,可用于制备新型可溶性、慢消化的产物,在淀粉改性领域具有广阔的应用前景。该文从葡萄糖基转移酶的来源与酶学性质、结构与进化、催化机理及应用的研究现状进行概述,为葡萄糖基转移酶的深入研究及利用其开发新型功能性食品提供参考。

甘油三酯-葡萄糖指数与γ-谷氨酰基转移酶在中青年代谢综合征诊断中的临床应用

目的探讨甘油三酯-葡萄糖(TyG)指数与γ-谷氨酰基转移酶(GGT)预测中青年代谢综合征(MS)的临床价值。方法选取2022年12月至2023年9月在首都医科大学附属北京世纪坛医院肥胖与代谢中心住院治疗的151例中青年MS患者作为研究对象(MS组),另选取同期在医院进行健康体检者130例作为对照组,分别测定两组的代谢及炎症指标。MS组根据MS组分数目分为MS3组(101例)、MS4组(32例)及MS5组(18例),比较三组TyG指数、GGT水平。采用Pearson相关检验分析TyG指数、GGT与MS诊断指标的相关性。通过多因素logistic回归分析MS发生的危险因素。使用受试者操作特征(ROC)曲线评估TyG指数、GGT预测MS的价值。结果MS组患者TyG指数、GGT显著高于对照组,MS5组TyG指数、GGT显著高于MS3组和MS4组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析显示,TyG指数、GGT水平与体重指数、舒张压、收缩压、空腹血糖、甘油三酯呈正相关(P<0.05),与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关(P<0.05)。Logistic回归分析显示,TyG指数、GGT均为MS的危险因素。ROC曲线分析显示,TyG指数、GGT预测MS的曲线下面积(AUC)分别为0.72(95%CI 0.66~0.781)、0.675(95%CI 0.612~0.739)结论中青年MS患者TyG指数、GGT表达明显增高,二者均与MS的发生密切相关。

Lactobacillus reuteri 1214,6-α-葡萄糖基转移酶GtfBdN改性薯类淀粉产物结构及理化特性研究

经过Lactobacillus reuteri 1214,6-α-葡萄糖基转移酶(4,6-α-glucanotransferase,4,6-α-GTase)GtfB改性淀粉可以得到一种具有益生潜力的水溶性膳食纤维。利用截断N端但高表达的全活性GtfBdN改性薯类淀粉,包括红薯淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉,对产物进行结构和性质测定。通过核磁共振光谱、高效尺寸排阻色谱和高效阴离子交换色谱分析表明,GtfBdN改性分别使红薯淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉中(α1→6)键比例提升至20.7%、19.5%和26.6%;产物相对分子质量减小,分子质量分布变广;聚合度>24的链段比例降低,聚合度6~12的链段比例大大增加。采用快速黏度分析仪、流变仪和差示扫描量热仪等测试发现,产物黏度大幅下降,表现出更多的流体行为,短期回生和长期回生减慢。该研究为4,6-α-GTase改性薯类淀粉在食品体系中的应用提供了理论和应用依据。

Bacillussp.HA-1产环糊精葡萄糖基转移酶发酵工艺研究

在10 L 发酵罐中,研究了环糊精葡萄糖基转移酶产生菌 Bacillus sp．HA-1的发酵规律,结果表明,在菌体对数增长期,发酵液溶氧处于较低状态,发酵液 pH 在对数增长前期持续下降,中期后回升,菌体产酶呈增长趋势；当菌体增长进入稳定期,发酵液溶氧迅速回升至初始状态,pH 也回升至起始值,菌体产酶接近峰值。根据发酵规律优化发酵工艺,通过有效增加菌体对数增长期发酵液溶氧,使菌株产酶到达高峰的时间缩短了 50%以上。应用该菌株在5 m^3生产罐中发酵,24 h 产酶水平达到6 800 IU/mL。

一株产环糊精葡萄糖基转移酶的地衣芽孢杆菌的选育、产酶条件及酶学特性

从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶 (CGTase)产生菌 4 0 3,96h发酵酶活为 0 95U mL。经紫外辐射和硫酸二乙酯复合诱变而获得突变株CLS4 0 3,96h发酵酶活达 1 36U mL ,提高 4 3%。该突变菌株被鉴定为地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis) ,产CGTase的最佳碳源为可溶性淀粉 ,最佳氮源为硝酸铵 ,最适初始pH为 6 5 ,最适培养温度为 35℃ ,发酵期间CGTase的产生高峰 (第 96h)滞后于菌体生物量高峰 (第 4 8h) 2d。菌株所产CGTase的最适反应pH为 6 0 ,最适温度为 5 5℃ ,在pH 6 0～ 7 5间和 5 0℃下保持 1h后的剩余酶活均达 90 %以上 ;酶液中适量添加Ca2 + 能大幅提高CGTase在 5 5℃下的稳定性。经高效液相色谱分析 ,CGTase作用于淀粉后的产物以α 环糊精为主 ,β 环糊精为次 ,二者比例为 2 4 7∶1,环糊精总产率达 2 9 8% ,但产物中不含γ

环状糊精与环状糊精葡萄糖基转移酶

本文简述了环状糊精的结构性质和用途,并对环状糊精葡萄糖基转移酶的测定方法和固定化做了简要综述。

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.

环糊精系列综述之一 环糊精葡萄糖基转移酶的筛选及其定向改造

环糊精因其特殊性质得到了食品、化妆品、医药等行业的青睐,全球消费量逐年稳步增加。环糊精的巨大需求也使其生产中所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶,EC 2.4.1.19)成为研究热点。目前,对该酶的研究多集中在作用机制、产物专一性机理等,鲜见从菌株筛选出发的系统性报道。因此,作者从野生CGT酶菌株的筛选出发,立足未来环糊精工业的商业诉求,综述了优质CGT酶获取的多种途径。同时结合国内外对CGT酶的大量研究工作以及我国的资源优势,对该领域未来的研究提出更高的期望。

高产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌选育、产酶与酶学特性

选育了一株高产环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的芽孢杆菌Sx菌株，经16SrRNA测序分析，结合菌体及菌落的形态特征，鉴定该茵株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。对其产酶条件与酶学特性进行了研究。结果表明，以1g／dL玉米淀粉和2g／dL豆粕粉为碳氮源，pH6．5，30℃，220r／min，60h的条件下，菌株所产CGTase酶活性可达5596U／mL；该酶在30～50℃，pH5．5-9．0下保持稳定，在50℃，180r／min，PH6．5，CGTase酶活力为1107U／mL的条件下对20mg／mL甜菊甙转化48h，甜菊甙溶液中的莱鲍迪甙与甜菊甙的比值（RA／SS）从转化前的0．45上升到0．53。

刺五加葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达分析

刺五加是中国的珍贵药用植物,UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,GT)是催化其三萜皂苷类成分生物合成的关键酶。利用RT-PCR和RACE技术,从该植物中分离出全长为1 959bp的GT基因cDNA序列,该基因开放阅读框为1 827bp,编码一个含608个氨基酸的蛋白质,分子量为6.672 3×104ku。生物信息学分析结果显示,该蛋白包含GT家族的标志性序列,不存在跨膜区域,定位于细胞质中,属于参与植物次生代谢的GT-B型。表达分析的结果表明,刺五加GT基因在各生长时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。最大表达量出现在盛花期,为最低表达量(叶片衰老期)的1.81倍。各器官中,叶片的表达量最高,是最低量幼茎的1.64倍。

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486 kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT(P51094.2)的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b(+)中,构建了表达载体pET-20b(+)/cgt,并将其转化表达宿主E.coliBL21(DE3)。对重组菌E.coliBL21/pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件:葡萄糖8 g/L,乳糖0.5 g/L,蛋白胨12 g/L,酵母膏24 g/L,K2HPO472 mmol/L,KH2PO417 mmol/L,CaC l22.5 mmol/L;初始pH为7.0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90 h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22.1 U/mL,与来源菌P.macerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3 L发酵罐中发酵,90 h后胞外酶比活达到22.6 U/mL,证实了工业化放大的可能性。

环状糊精葡萄糖基转移酶的研究进展

环状糊精葡萄糖基转移酶是催化淀粉等合成环状糊精的酶,环状糊精由于具有特殊的理化性质,能将多种化学物质包接在其环形空隙中,因此在食品等领域有着广泛的应用前景。本文对环状糊精葡萄糖基转移酶的来源、酶学性质、作用机理、筛选及分子生物学方面进行了系统的综述。

嗜热芽胞杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽胞杆菌中的表达

【目的】构建分泌表达α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)的重组枯草芽胞杆菌,实现α-CGTase的安全高效表达。【方法】通过PCR法扩增嗜热地芽胞杆菌α-CGTase基因,运用EcoRI/XhoI分别对α-CGTase基因及pBES进行双酶切,然后将该基因片段插入到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭载体pBES中,再电转化法转化枯草芽胞杆菌RIK1285;对重组枯草芽胞杆菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT发酵条件进行探索。【结果】(1)利用发酵培养基分泌表达α-CGTase,重组枯草芽胞杆菌工程菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT发酵上清液产酶达到2.9U·mL-1。(2)TB为最适发酵培养基(配方:甘油0.5%,蛋白胨1.2%,酵母粉2.4%,K2HPO41.64%,KH2PO40.23%);在初始pH6.5,温度为37℃下,摇瓶发酵培养24h后,α-环糊精酶的环化活性达到5.3U·mL-1,是野生菌株嗜热地芽胞杆菌(0.66U·mL-1)的8倍。【结论】成功构建了枯草芽胞杆菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT工程菌,并确定其最适发酵培养基和培养条件。

环糊精及环糊精葡萄糖基转移酶特性研究

环糊精以其独特的理化特性广泛应用于制药、食品、农业及化妆品等领域,环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是合成环糊精的关键酶。综述了环糊精葡萄糖基转移酶的筛选策略、CGTase的定位、催化机制、环糊精的生产过程及其在生产中的具体应用。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因多态性的研究进展

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)是生物体内进行第Ⅱ相生物转化时最重要的一种酶。UGT广泛分布于人体的肝、肾和肠等不同组织,代谢大量的外源性毒性物质和内源性物质。研究发现,UGT1A基因多态性是个体间葡萄糖醛酸化活性差异的重要原因之一。本文就UGT1A基因多态性的研究现状予以综述。

β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株02-5-71的选育及发酵条件研究

应用氮离子注入对嗜碱芽孢杆菌进行诱变育种,获得了产生β-环糊精葡萄糖基转移酶是出发菌株2倍以上的高产菌株,酶活力可达6000U/mL以上.应用正交实验法筛选出最优发酵条件.