Ⅱ型葡萄糖异构酶N端随机卷曲序列的嫁接效应

木糖/葡萄糖异构酶(xylose/glucose isomerase,XIase/GIase)是果葡糖浆生产的关键用酶,也是重要的模式酶,其组成域的结构和功能一直是研究的热点。本研究采用重叠PCR技术将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶(TTGIase)N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的I型葡萄糖异构酶(TFGIase)的N端,构建了融合蛋白NTFGIase。发酵实验结果显示,在相同培养和诱导条件下,N-TFGIase菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%;酶学检测结果显示,N-TFGIase比酶活较TFGIase高出26%,最适温度较TFGIase高出5℃,75℃下的半衰期较TFGIase延长30%,最适p H较TFGIase降低1.0。序列分析表明,TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构,提高了融合蛋白的表达效率;其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0,利于融合蛋白的初始折叠和包装;其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍,减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。实验结果提示,将来自超嗜热菌的Ⅱ型XIase/GIase的N端随机卷曲序列融合到I型XIase/GIase N端,能够提高后者的热稳定性、酸稳定性和表达效率等酶学性质,与我们的预测结果相一致,这为酶的分子改造和生产应用提供了参考。

葡萄糖异构酶在秸秆发酵中的应用

利用葡萄糖异构酶对秸秆水解液中的D -木糖进行异构化研究。试验结果表明 ,在80℃ ,pH9 0 ,酶与底物的质量比为 1∶1 2 5,加入Mg2 +的浓度为 0 1 5mol/L ,Co2 +的浓度为0 0 1mol/L ,反应时间为 4 8h条件下 ,可使木糖异构率达 58%以上。

旋光法测定葡萄糖异构酶活力

葡萄糖异构酶的活力以规定条件下单位时间内生成的果糖量表示。测定果糖的既有方法中,咔唑-半胱氨酸盐法手续麻烦,旋光法则因多种糖混存而使工作量加大。因此这两种方法在测定大批样品时都不理想。我们参考丹麦Novo公司和美国Miles公司有关资料。

蒿甲醚对小鼠体内日本血吸虫的己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶的影响(英文)

目的：研究蒿甲醚（Ａｒｔ）对血吸虫己糖激酶（ＨＫ）、磷酸葡萄糖异构酶（ＧＰＩ）和磷酸果糖激酶（ＰＦＫ）的影响。方法：感染血吸虫小鼠１次ｉｇＡｒｔ１００或３００ｍｇｋｇ－１，并分别于２４ｈ和４８ｈ剖杀取虫。按生成ＮＡＤＰＨ和耗用ＮＡＤＨ的方法测定上述３种酶活力。结果：感染鼠ｉｇ．Ａｒｔ３００ｍｇｋｇ－１后２４ｈ，♀、虫体ＨＫ活力抑制率分别为３３．３％和１３．７％，ＧＰＩ活力则分别抑制１４．７％和１７．５％，４８ｈ后，♀、虫体的ＧＰＩ活力抑制率分别为４６．２％和３２．９％。但Ａｒｔ剂量为１００或３００ｍｇｋｇ－１时，给药后２４ｈ和４８ｈ的♀虫ＰＦＫ抑制率分别为６４．９％和７１％，均明显高于虫的１６．３％和５４．２％。结论：ＰＦＫ可能是Ａｒｔ作用于血吸虫糖酶解途径的靶酶之一。

7号淀粉酶链霉菌M1033菌株葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的高效表达

从已克隆的含７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３菌株产葡萄糖异构酶基因的质粒ｐＵＢ中，用ＤｄｅＩ和Ｋｐｎｌ酶解，分离出酶结构基因，以平端方式与大肠杆菌质粒ｐＴ７７连接，构建了重组表达质粒ｐＴＫＤＧＩ。将ｐＴＫＤＧＩ转化到特异大肠杆菌寄主Ｋ３８，经４２℃热诱导，所产葡萄糖异构酶占菌体可溶性蛋白３５％。通过ＤＥＡＥ－Ａ５０柱和Ｇ－１５０柱层析，发酵液可获电泳纯蛋白３４ｍｇ／Ｌ。

底物及其类似物对葡萄糖异构酶有关光谱的影响

采用均一态葡萄糖异构酶为试样,在其与底物或底物类似物共存下,测定了UV谱、荧光光谱和CD谱。

7号淀粉酶链霉菌M1033木糖异构酶基因序列分析

测定了来自海南的7号淀粉酶M1033木糖异构酶(Ⅺ)基因的DNA序列。该酶的结构基因由1161bp组成,相当于387个氨基酸残基。其GC含量为72.1克分子％,密码子第三位的GC利用率达98克分子％。在氨基酸序列上,M1033的木糖异构酶与其它放线菌菌株的相比具有较高的同源性;特别是与3种链霉菌菌株的同源性高达90％左右。

嗜热脂肪芽孢杆菌耐热木糖异构酶的特性

嗜热脂肪芽抱杆菌在木糖或木聚糖诱导下产生木糖异构酶。从破碎细胞中分离到该酶。经硫酸铵沉淀，热处理及SephadexG-200柱层析等步骤获得纯化了19倍的酶制备物。该酶反应的最适pH值为7.5，在pH6．2～8．0范围内稳定，最适反应温度为80℃，低于此温度时酶有很好稳定性。该酶对底物木糖的Km值为6．67mmol／L，Mg2+、Co2+和Mn2+对该酶有激活作用，而Zn2+、Cu2+和Fe2+对酶有抑制作用。酶制备物转化木糖为木酮糖产率为18％。

以木糖异构酶基因为筛选标记的玉米遗传转化

利用木糖异构酶基因作为筛选标记可以在含有不同浓度木糖的培养基上筛选出玉米再生植株,其中50%～100%木糖浓度的总体筛选效果较好,但不同玉米基因型之间筛选的最佳浓度差异很大。通过DNA点杂交、PCR及PCR-Southern印记法检测表明,木糖异构酶基因已经整合到转基因植株中。以木糖作为筛选剂,可以减小潜在的生物安全隐患。

链霉菌M1033 D-木糖异构酶的分子克隆

链霉菌M1033染色体DNA经BamH Ⅰ酶解后电泳,Southern转移。根据自测的链霉菌ML033 D-木糖异构酶氨基酸序列设计合成寡聚核苷酸探针X-2、X-3,以X-2、X-3及Ampullariella sp3876 D-木糖异构酶基因(1.17kb)为探针进行杂交,确定与上述探针杂交最强处在15kb左右。从胶上分离出9—20kb大小的片段,克隆到EMBL 3载体中,经杂交筛选后,得到0.6%的阳性噬斑,其插入大小为13kb。将插人DNA的Sal Ⅰ酶解片段(2.5kb)进一步亚克隆于pUC18,得到重组质粒pUB 1,经酶解图谱、部分序列分析和互补实验确定pUB1含有完整的M1033

嗜热细菌木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中的高效表达

采用ＰＣＲ技术克隆得到嗜热细菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ木糖异构酶（ｘｙｌｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅＸＩ）基因ｘｙｌＡ，将该基因连接于酵母表达载体ｐＭＡ９１的磷酸甘油激酶（ＰＧＫ）启动子下，得到重组质粒ｐＢＸ１。通过ＬｉＡｃ完整细胞转化法将重组质粒转移至酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈ１５８受体菌中，得到重组酵母转化子Ｈ６１２，酶活测定结果表明，成功地在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结果显示出明显的特异性表达产物带，单体分子量为４３ｋＤ。由酿酒酵母重组子Ｈ６１２产生的木糖异构酶最高酶活条件与其在自然状态下的一致，均为８５℃，ｐＨ７０，在这一条件下酶的比活力为１０Ｕ／ｍｇ蛋白，而在接近酵母最适生长温度的３０℃和４０℃时，其相对酶活分别下降３７％和１１％。研究结果显示在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达，为进一步在酿酒酵母菌中建立新的木糖代谢途径打下了基础。

以木糖异构酶基因作为选择标记的花生遗传转化

用木糖异构酶基因xylA替换掉pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase,Hpt),构建了植物表达载体pCAMBIA1301-xylA。再利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-xylA导入花生,转移到添加蔗糖(5g/L)和不同浓度木糖(5,10,20,30g/L)的体胚诱导及体胚萌发培养基上培养。对外植体成苗率及转基因阳性率进行统计,结果表明,当木糖浓度为10g/L时,诱导成苗率为15.25%,再生植株生长健壮,且转基因阳性率高达77.27%,最终确定10g/L为最适木糖筛选浓度。该筛选方法利用木糖作为筛选剂,可以避免利用抗生素筛选可能造成的安全隐患,转化效率高,是一种安全、高效的筛选方法。

酿酒酵母中的嗜热细菌木糖异构酶活性表达及木糖代谢研究

将来自嗜热放线细菌Thermobif ida f usca的木糖异构酶(xylose isomerase,XI)基因xylA,连接于酵母表达载体pYES2的半乳糖诱导启动子(PGAL)下,得到重组质粒pYES2-xylA,用其转化酵母菌INVSc1,测定重组酵母菌株INVSc1-xylA的木糖异构酶活性,并对重组酵母菌株进行木糖葡萄糖共发酵试验,探讨在酿酒酵母中建立新的生产乙醇木糖代射途径。结果木糖异构酶在75℃,pH值6.8的酶活力最高,在酿酒酵母中成功地获得活性表达,并且SDS-PAGE电泳有明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD。INVSc1-xylA在木糖葡萄糖共发酵实验中消耗木糖和产生乙醇分别比对照菌提高53.8%和36%,提高了其生产乙醇的能力。

木糖异构酶在酿酒酵母表面表达及对木糖代谢影响的初步研究

利用α-型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示系统的载体,将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus的木糖异构酶基因xylA,插入到酿酒酵母蔗糖酶信号肽序列与α-凝集素的C端编码序列之间,形成融合表达框,构建重组质粒pSY-xy222,转化酿酒酵母H158。含重组质粒的菌株H158-SXI木糖异构酶活性测定表明,细胞壁上酶活测定值为1.53 U,木糖异构酶在酿酒酵母细胞壁上得到活性表达。木糖葡萄糖共发酵结果显示,重组菌株木糖利用率较出发菌株提高了17.8%。

木糖异构酶在酿酒酵母细胞表面的展示

将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus的木糖异构酶基因xylA,与酿酒酵母(Sac-charomyces cerevisiae)a-凝集素表面展示载体pYD1的Aga2p亚基C端序列融合。编码融合蛋白的基因序列前接上半乳糖诱导型启动子。用LiAc完整细胞法转化酿酒酵母EBY100。含重组质粒的菌株EBY100/pYD-xylA经半乳糖诱导表达外源融合蛋白,免疫荧光显微镜结果显示外源蛋白被锚定在细胞壁上,木糖异构酶活性测定结果表明,细胞壁上酶活测定值为1.52U,木糖异构酶在酿酒酵母细胞壁上得到活性表达。

蛇足石杉1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(HsDXR1)基因克隆与表达分析

基于本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,获得一个编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)的转录本,分析其开放阅读框序列,发现该转录本编码全长为1 440 bp的蛇足石杉DXR基因(HsDXR1),含有479个氨基酸残基。采用RT-PCR方法获得了HsDXR1全长,并对HsDXR1编码蛋白的理化性质、结构域及三维结构进行预测分析。结果显示HsDXR1编码蛋白的预测分子量为51.496 1 kDa,等电点为6.44;不含信号肽和跨膜区;亚细胞定位预测表明该蛋白最可能定位于叶绿体;具有DXR蛋白典型的结构域。实时荧光定量PCR检测HsDXR1基因在蛇足石杉的茎中表达量最高,其次为根,在叶中表达量最低。本研究获得了蛇足石杉HsDXR1基因的编码区序列,为进一步研究HsDXR1在蛇足石杉萜类化合物生物合成途径中的功能奠定基础。

植物萜类合成酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的分子结构特征与功能预测分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的拟南芥、玉米、岩蔷薇、水稻、黄花蒿、亚麻等植物的萜类合成酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、转运肽、跨膜拓朴结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行预测和推断。结果表明:该类酶基因的全长包括5′、3′非翻译区和一个开放阅读框,无跨膜结构域,是一个具转运肽的亲水性蛋白,包括两个功能DXR结合motif及两个功能NADPH结合motif,α-螺旋和不规则卷曲是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和β-折叠散布于整个蛋白质中,蛋白质的功能域在空间结构上折叠成“V”形,“V”形的两臂由N-端与C-端构成,“V”形的底部,是N-端臂与C-端臂的结合域。

拟南芥木糖异构酶在酿酒酵母的成功表达(英文)

酿酒酵母是工业上乙醇发酵的首选目标微生物,但是不能代谢木糖等五碳糖。通过导入外源木糖异构酶基因,可以赋予酵母利用木糖的能力。但是长期的研究发现很难将细菌木糖异构酶转入酿酒酵母得到活性表达。研究成功的在酿酒酵母里表达了拟南芥木糖异构酶,其活性可达到0.51 U/(mg protein)。拟南芥木糖异构酶与成功在酵母里表达的真菌木糖异构酶相比更加耐受木糖醇抑制(Ki=13.21 mM)。本研究为改善酵母利用木糖提供了新的可用的木糖异构酶。

E·coli木糖异构酶基因的克隆及表达条件的优化

采用PCR技术以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板扩增得到木糖异构酶基因xylA,连接到载体pET-22b(+),得到重组质粒pET-22b(+)-xylA。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测得木糖异构酶活力。每mL发酵液中重组菌株显示出酶活力约为0.84 U。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的5×104(相对分子质量)特异性蛋白质条带。

Thermus thermophilus木糖异构酶与木糖醇的分子对接及模型分析

Xylose isomerase from Thermus thermophilus is widely used in the production of high-fructose corn syrup and the construction of xylose via recombinant strains. In this paper, the positions of Mg ions and xylitol in 1BXB were established by structure analysis, molecular docking and computing. The Complex of 1BXB with xylitol was modeled and analyzed. Comparing the structure of 1BXB complex with 1S5N, it was found that the overall structure of them showed a high similarity. The residues around xylitol were highly conserved in xylose isomerase, and the orientation and positions of xylitol were very similar in both structures. The coordination bonds formed between Mg1 and O2 or O4 of xylitol stabilized the conformation of xylitol at the active site of 1BXB.