应用细胞透性化技术快速提取氧化葡萄糖杆菌胞内右旋糖酐糊精酶

将细胞透性化技术应用到右旋糖酐酶的提取检测过程中,根据单因素实验和正交试验设计确定了从氧化葡萄糖杆菌（Gluconobacter oxydans）细胞中提取胞内右旋糖酐糊精酶（DDase）的最佳方法：甘氨酸（Gly）质量分数15%,Triton X-100体积分数1%,菌悬液OD600为0.5~6.0,pH为6.81,冰浴处理时间1 h,透性化试剂的提取效率可达到酶活最大值的90%以上。与超声波细胞破碎法相比,该方法条件温和,酶的释放率较高并易于大量试样的平行实验操作。

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的缩合反应生成聚十异戊烯焦磷酸 ,构成辅酶 Q1 0 的侧链。将氧化葡糖杆菌 ( Gluconobacter oxydans)的染色体 DNA用 Eco RI酶切 ,回收 5 .0 kb左右的片段为模板 ,通过 PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因 ( dds A)。测序分析表明该基因有一个 95 1 bp的开放型阅读框架 ,氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性 ( 30 %～ 5 0 %)。将 dds A基因克隆到 p UC1 9载体上得到 p UC- GZH表达质粒 ,将其转入大肠杆菌 JM83宿主 ,经 IPTG诱导表达融合蛋白 ,在聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE)的

响应面法优化氧化葡萄糖杆菌生产高浓度二羟基丙酮工艺

采用响应面法优化氧化葡萄糖杆菌甘油脱氢酶的反应及稳定性条件,以提高二羟基丙酮的发酵浓度.结果表明甘油脱氢酶在pH 4.61,温度33.3℃,甘油质量浓度80.0g·L-1时有最高的酶活性;但该酶仅在pH 4.0～5.0很窄范围内及温度低于25℃以下时稳定;100g·L-1甘油或者50g·L-1二羟基丙酮对该酶的稳定有利.由于氧化葡萄糖杆菌的生长条件和甘油脱氢酶催化条件差异较大,为提高二羟基丙酮的转化效率,研究了一种新的二羟基丙酮的转化方法.该方法将二羟基丙酮的发酵过程分成菌体培养期和甘油转化期2个阶段,分别控制其最优条件.实验中利用一个5-L的发酵罐的进行转化,结果显示在136h的转化过程中甘油脱氢酶的稳定性保持良好,最终发酵液中的二羟基丙酮质量浓度达到286.2g·L-1.

快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增方法的建立

建立赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测发酵乳中葡萄糖杆菌的方法。选择葡萄糖杆菌ITS基因序列(基因号为KF896260.1)为目的基因,设计特异性引物,并优化反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的添加量,建立最优反应体系。采用建立的HDA体系对多种菌株进行扩增和电泳检测,验证方法特异性,通过HDA法直接检测发酵乳中的葡萄糖杆菌,并确定其检出限。结果表明:采用HDA法检测发酵乳中葡萄糖杆菌,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的适宜添加量分别为0.10μg和5.0μg,扩增产物与设计序列长度(309 bp)一致,特异性良好,检出限为4.3×10^1 CFU/g。该方法用于检测发酵乳中葡萄糖杆菌的灵敏度高、耗时短。

过表达果糖脱氢酶促进氧化葡萄糖酸杆菌高效合成5-酮果糖

5-酮果糖(5-KetoFructose,5-KF)具有与D-果糖相似的甜度和自然甜味,且不能被人体代谢而具有低热量的优点,是一种具有发展前景的非营养型天然甜味剂。为了获得5-酮果糖高产菌株,作者将来源于Gluconobacter japonicus的膜结合的果糖脱氢酶基因在Gluconobacter oxydans中过表达,通过对不同的宿主、表达载体和启动子的筛选,获得一株能够高效合成5-KF的工程菌QT-10。在3 L发酵罐中进行补料发酵优化,最终采用恒速连续流加果糖的方式,该工程菌可在82 h内消耗质量浓度为650 g/L的D-果糖,5-KF的产量高达608 g/L,产率为94.6%,时空产率为7.41 g/(L·h)。

氧化葡萄糖杆菌合成右旋糖酐糊精酶的pH两阶段控制策略

为了进一步提高氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶的产量,在3 L发酵罐水平上考察了pH(3.5?6.0)对菌体生长和产酶的影响。基于不同pH发酵过程中菌体生长及产物合成的变化,确定了pH两阶段控制策略,即0?6 h时控制pH 5.0,6 h后将pH调至4.0。通过采用这一优化策略,右旋糖酐糊精酶酶活有了较大的提高,可达4.03 U/mL,比不控制pH模式下提高了38.5%,是摇瓶水平的12.5倍,同时发酵时间从47 h缩短为15 h。

混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用

为查明维生素C二步发酵混合培养中巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌间的关系,通过生长曲线测定、静息细胞实验及摇瓶发酵实验研究了巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产生2酮基L古龙酸作用的影响;采用超滤分离、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中具有促进氧化葡萄糖酸杆菌产酸作用的活性物质进行了分离和纯化.结果表明,大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长,大菌胞外液中具有该作用的组分分子量在100KDa以上;大菌胞外液具有促进小菌转化L山梨糖生成2酮基L古龙酸的作用,其胞内液无该作用;大菌胞外液中具有该活性作用的组分为30～50KDa和大于100KDa两个部分.其中30～50KDa范围的大菌胞外液中的活性组分为一种蛋白质,其表观分子量约为35KDa,由一种亚基构成。

维生素C二步发酵中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸的影响

通过测定氧化葡萄糖酸杆菌转化L－山梨糖中成ZKGA的细胞酶活性、摇瓶发酵及中长变化，研究了Vc:步发酵中巨大茅孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸作用的影响。结果显示：巨大芽孢杆菌胞外液和胞内液均可促进氧化葡萄糖酸杆菌的增殖，主要表现为缩短其中长周期中的延迟期；巨大芽孢杆菌通过所产生的部分生物活性物质增强氧化葡萄糖酸杆菌产酸的细胞酶活性，促进氧化葡萄糖酸杆菌转化L一山梨糖生成2KGA.

离子注入氧化葡萄糖酸杆菌的诱变效应

本文运用离子注入对维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的产生菌氧化葡萄糖酸杆菌的诱变效应进行了研究,确立了以8%甘油作保护剂,并就低能离子注入条件进行了参数设定。

氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞转化乙二醇制备乙醇酸

考察了利用氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞转化乙二醇制备乙醇酸的工艺过程。在分批转化的条件下,100 g/L的乙二醇溶液经过30 h左右的反应,生成118.5 g/L的乙醇酸,转化率达到97%以上,静息细胞可以连续使用3个批次,平均转化率达到93.3%。通过补料分批转化,可以进一步的提高产量,经过38 h的反应得到182.5 g/L的乙醇酸,大大提高了转化液中的产物浓度。

氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究

通过超速离心收集膜组分、表面活性剂溶解膜蛋白、CM-纤维素柱层析纯化等步骤,从氧化葡萄糖酸杆菌DSM2003中获得电泳纯的具有1,2-丙二醇脱氢酶活性的脱氢酶,此酶由两个亚基组成,其表观相对分子质量分别为80000和50000。经MALDI-TOFMS-MS质谱分析与肽质量指纹图谱检索鉴定,证明纯化得到的酶是乙醇脱氢酶。酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为30℃,最适pH值为5.5～6.0;该酶能催化多种一元醇、二元醇,但对包含3个以上羟基的多元醇基本无氧化活性;其催化活性随着底物碳链长度的增加而减小;大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA等)对此酶活性均有抑制作用。

氧化葡萄糖酸杆菌原生质体的形成和再生研究

报道氧化葡萄糖酸杆菌原生质体的形成和再生的方法。将最佳生长条件下对数生长后期的培养物以溶菌酶处理,YE培养基上再生原生质体、原生质体形成率约99%,再生率2.93%。

氧化葡萄糖酸杆菌的固定化及在鼓泡式反应器中制备乙醇酸

考察了包埋法固定氧化葡萄糖酸杆菌的过程,并且研究了利用该固定化细胞在鼓泡塔生物反应器中转化乙二醇制备乙醇酸。固定化的最优条件为:聚乙烯醇的最佳质量分数为8%,海藻酸钠为0.8%,最适湿细胞包埋量为每毫升凝胶0.27 g。固定化细胞对酸碱的抗性和热稳定性均较游离细胞有所提高。利用固定化细胞在鼓泡式反应器中转化乙二醇制备乙醇酸,在乙二醇质量浓度70 g/L的条件下,首批转化率达到92.6%,并且可以实现连续转化6个批次,平均转化率在85%以上。

几种外源物质对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2-酮基-L-古龙酸的影响

通过在发酵培养基中添加不同的外源营养物质及巨大芽孢杆菌的培养上清液,研究其对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)的影响。结果表明,添加适量的谷氨酸单钠(MSG)、腺苷三磷酸(ATP)、含氮碱基、二氢叶酸和巨大芽孢杆菌的培养上清液都能够促进菌体增殖并提高2-KGA产量,而且2-KGA产量与生物量呈正相关。巨大芽孢杆菌的培养上清液促进菌体生长和产2-KGA的作用远大于以上各种外源营养物质。添加培养36 h的巨大芽孢杆菌胞外液后,氧化葡萄糖酸杆菌的菌落数和2-KGA产量分别是对照的13.39倍和8.81倍,而添加外源营养物质中促进作用最大的二氢叶酸后仅为对照的4.12倍和2.97倍。这表明,2-KGA产量的增加主要是通过促进氧化葡萄糖酸杆菌的菌体增殖实现,巨大芽孢杆菌的培养上清液促进氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸的机制不同于其他外源营养物质,可能是通过某种生物活性物质提高氧化葡萄糖酸杆菌菌群密度来实现。

氧化葡萄糖酸杆菌驯化选育及其产二羟丙酮

通过梯度增加种子培养基中甘油浓度驯化氧化葡萄糖酸杆菌(Cluconobater oxydans),有效地提高了该菌对甘油的耐受性,菌株产二羟丙酮水平比驯化前提高了29%,在此基础上,采用单因素试验,对其发酵工艺进行优化。考察甘油质量浓度、酵母膏质量浓度、CaCO_3质量浓度、接种量对发酵的影响,结果显示最佳工艺条件为:甘油质量浓度为60 g/L,酵母膏质量浓度为5 g/L,CaCO_3质量浓度为10 g/L,接种量4%,在此条件下,经72 h摇瓶发酵甘油转化率达96%,二羟丙酮产量可达57.4 g/L,7.5 L发酵罐分批发酵54 h时甘油转化率达97%,二羟丙酮产量可达58.2 g/L。

氧化葡萄糖酸杆菌的选育及其发酵条件优化

目的提高氧化葡萄糖酸杆菌的生物量。方法采用紫外诱变育种、梯度平板半理性设计筛选、单因素实验进行培养条件优化、2 L发酵罐内进行补料培养。结果筛选到了一株生物量高产菌株,命名为Gouv2007,其生物量比原始菌株提高了11.2%,脱氢酶比酶活与原始菌株持平,培养时间缩短了6 h。该菌生长的最佳碳源为山梨醇,氮源为酵母粉,无机离子为硫酸镁和磷酸氢二钾;最佳培养条件为:培养温度28℃,500 mL烧瓶装液量100 mL、摇床转速200 r/m in、培养基的初始pH自然。在最佳条件下培养,其生物量为1.34 g/L,比原始菌株提高了50.6%,脱氢酶比酶活有所提高。在2 L发酵罐内补料培养,其生物量达到了5.58 g/L。结论通过紫外诱变育种和条件优化提高了该菌的生物量,并在发酵罐内进行了小试。

氧化葡萄糖酸杆菌酶学和分子生物学研究

对氧化葡萄糖酸杆菌初级代谢途径中的关键酶及分子生物学研究做了系统的评述 ,展望了分子技术改造氧化葡萄糖酸杆菌和优化 2 KGA代谢途径的可能。

直投式木葡萄糖醋酸杆菌发酵剂的保护剂筛选研究

利用冷冻干燥技术制备一种直投式木葡萄糖醋酸杆菌的复合保护剂,先采用单因素试验优选出10%脱脂奶粉、5%海藻糖、1%谷氨酸可作为木葡糖醋酸杆菌发酵剂的单一保护剂,然后采用响应面分析法优化了直投式木葡萄糖醋酸杆菌复合保护剂中脱脂奶粉、海藻糖、谷氨酸的浓度和配比。结果表明,当复合冻干保护剂中含脱脂乳6.4%、海藻糖0.075%、谷氨酸0.575%时,木葡萄糖醋酸杆菌冻干后细胞的存活率最高、达93.346%。对比试验表明,添加复合冻干保护剂的发酵剂与同浓度的活菌液体发酵剂的细菌纤维素产率差异不显著。

氧化葡萄糖酸杆菌培养及生物转化性能的研究

对氧化葡萄糖酸杆菌在山梨醇培养基中的生长及其静息细胞对山梨醇的氧化做了动态研究。实验结果表明:作为碳源的山梨醇对该菌的生长具有明显的抑制作用,当山梨醇的浓度为2%时,该菌生长最好,底物利用率高。当装液量为20ml时,该菌静息细胞浓度为1.0mg干细胞重/ml时,转化效果最好,34h产物收率就达到77%,当装液量为10ml时,该菌静息细胞浓度为2.0mg干细胞重/ml时,转化效果最好,16h产物收率就达到90%。另外,在该菌的生长和其静息细胞转化山梨醇时,都不加入镁离子,该菌静息细胞对山梨醇无转化。

甘油诱导氧化葡萄糖酸杆菌山梨醇脱氢酶

在山梨醇培养基中,梯度增大甘油质量浓度诱导提高氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞山梨醇脱氢酶活力。当甘油质量浓度为20 g/L时,山梨醇脱氢酶的比酶活达到114 U/mg,比未用甘油诱导的提高了67%。甘油诱导后的山梨醇脱氢酶对山梨醇的亲和力增加至1.34倍(Ks从51 mmol/L变为38 mmol/L);同时其储存稳定性提高,用甘油诱导的菌体静息细胞储存30 d后,其山梨醇脱氢酶比酶活是新制备菌体静息细胞的75%,未诱导的只有30%。该工作的新颖性已为陕西省科学技术信息研究所科技查新中心2008年9月18日出具的第2008729号《科技查新报告》所证实。