葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联体系葡萄糖分析

酶催化反应具有高效、快速、高选择性,在定量分析领域应用广泛.本文采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联体系,用动力学方法对样品中葡萄糖含量进行分光光度测定,得到了较为满意的结果.

疏水-亲水型硅胶固定化葡萄糖氧化酶的研究

目的 评价疏水 亲水型硅胶作为载体固定化葡萄糖氧化酶的性能 ,以期制备出能用于临床体液中葡萄糖浓度测定的生物传感器。方法 以甲基三甲氧基硅 (MTMOS)和γ 氨丙基三甲氧基硅烷 (APTMOS)为原料 ,利用溶胶 凝胶技术制成了一种疏水 亲水型硅胶 ,以 1 乙基 3 (3 二甲基氨丙基 ) 碳二亚胺·盐酸 (EDC)和N 羟基琥珀酰亚胺(NHS)为催化剂 ,利用葡萄糖氧化酶 (GOD)分子中的羧基基团与硅胶中氨基基团间的碳二亚胺偶联反应 ,实现了GOD在硅胶上的固定化 ,考察了固定化GOD的基本性质。结果 固定化GOD活力最优时的条件如下 :APTMOS的体积分数为 70 %、给酶量为 16 80 0U、最适温度和最适pH值分别为 35℃和 5 .5 ,固定化GOD具有很好的操作稳定性和贮存稳定性 ,其米氏常数Km为 9.1mmol·L-1。结论 疏水 亲水型硅胶是一种新型的酶固定化载体 ,可用于多种酶的固定化。

尿酸酶-过氧化物酶偶联法试剂对邻-甲酚酞络合酮法血钙测定结果的影响分析

全自动生化分析仪的临床应用,提高了生化检测的准确性、精密度和工作效率,适应了临床医学对检验医学的要求。但在实验过程亦可能产生交叉污染的问题,值得引起实验室工作人员的注意。

血清谷胱甘肽过氧化物酶偶联连续监测法

应用偶联连续监测法测定血清谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ），特异性强，灵敏度高，快速、准确。本法批内ＣＶ为３．９％，批间ＣＶ４．９％。在最适条件下，反应的吸光度差（ΔＡ）４ｍｉｍ之内呈线性。胆红质高于正常１０倍不影响结果，避免溶血。测定２３９例年龄５８～８２岁健康中老年人，参考值为７．５５±１．４３μｋａｔａｌ／Ｌ。

高活性辣根过氧化物酶-金纳米偶联物的制备与表征

以辣根过氧化物酶（HRP）为模型，研究了一种新型的将蛋白分子固定在金纳米粒子（GNP）表面的方法，制备得到一种高活性的辣根过氧化物酶-金纳米粒子生物偶联物。采用水溶性碳化二亚胺法制备了生物素化辣根过氧化物酶在柠檬酸根离子稳定化的金纳米粒子表面，通过静电吸附链霉亲和素。生物素-亲和素体系方便地制备得到高活性的HRP—GNP生物偶联物，单位酶活力提高了10倍以上。HRP—GNP生物偶联方法在制备高活性的生物探针和固定化酶等领域具有广泛的应用前景。

多酶偶联反应体系的研究和应用

多酶体系具有高效率、高选择性、高度协调性 ,其应用日益广泛 ,涵盖医药、食品、环境保护等领域。综述了自偶联和种间偶联两种多酶偶联形式在生物合成方面的研究和应用 ,阐述了多酶偶联反应体系的研究发展趋势。

水/有机溶剂双相酶偶联体系不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

酶分子经济性是评估单位酶催化剂分子催化效率的常数,其定义为单位酶活力催化的时空产率,即比时空产率。本研究以模式底物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为研究目标,系统考察了底、产物对参与催化反应的羰基还原酶(CR2)及葡萄糖脱氢酶(GDH)各自酶活力的毒害及抑制作用,对此从17种有机溶剂中筛选较适合该体系的有机溶剂-邻苯二甲酸二丁酯,进一步确定水/有机双相最佳反应比例为1:1。在此基础上,采用先单水相后双相的反应形式,结合底物补料策略将底物浓度提高至300 mmol/L,反应6 h后产物得率高达97.4%,光学纯度大于99.9%e.e.,有机相中产物浓度达到475 mmol/L,比时空产率达到16.2 mmol/L·h·U,相比于所报道的酶偶联体系,本研究构建的双相体系具有较好的酶分子经济性。

以3,3′,5,5′-四甲基联苯胺为底物的伏安酶联免疫分析体系研究

对 3 ,3′,5 ,5′ 四甲基联苯胺 (TMB) H2 O2 辣根过氧化物酶 (HRP)伏安酶联免疫分析体系进行了研究。HRP催化H2 O2 氧化TMB ,其氧化产物在汞电极上可以发生还原反应 ,在B R缓冲溶液中 ,-0 .76V(vs.SCE)处产生较为灵敏的伏安波。将此伏安波应用于测定HRP和HRP的标记物。测定HRP的线性范围为 6.0×1 0 - 1 1 ～ 5 .0× 1 0 - 9g mL ,检测限为 5 .0× 1 0 - 1 1 g mL。

二苯胺-H_2O_2-HRP伏安酶联免疫分析新体系的研究

提出了以二苯胺为底物的伏安酶联免疫分析新体系测定辣根过氧化物酶 (HRP)的方法 .通过线性扫描二阶导数极谱法测定 HRP催化 H2 O2 氧化二苯胺的产物 ,从而间接的测定 HRP的浓度 ,进而用于酶联免疫分析 .在 p H=8.5的 Britten-Robinson(BR)缓冲溶液中 ,二苯胺的氧化产物可以在 -0 .53V(vs.SCE)左右处产生一个灵敏的极谱还原峰 .在选定的最佳条件下 ,应用此峰测定 HRP的检测限可达 1 .0× 1 0 - 9g/m L,测定 HRP的线性范围是 4 .0× 1 0 - 9～ 2 .0× 1 0 - 7g/m L.另外 。

G蛋白偶联受体124在牙周炎中潜在作用机制及研究进展

G蛋白偶联受体124(G protein-coupled receptor 124,GPR124)可通过促进血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎症小体和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorsγ,PPARγ)介导牙周炎发生、发展的过程,引起牙龈微循环恶化、内皮细胞炎性损伤等病理改变。本文将总结GPR124的生物学特征并详细阐述GPR124与NLRP3、VEGF和PPARγ在牙周炎进程中的可能关系,为牙周炎或牙周炎伴全身性疾病的患者提供新的治疗思路。

磁珠分离酶联免疫测定法在检测人血清肌红蛋白中的应用

目的 建立一种宽范围的定量检测人血清肌红蛋白(Mb)的磁珠分离酶联免疫测定法。方法 使用 国产聚苯乙烯磁珠,经碳化二亚胺活化表面自由羧基,得以与抗Mb单抗偶联,用此抗体包被磁珠作为固相,另 一Mb单抗标记辣根过氧化物酶,做双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血清Mb,共检测临床血清标 本50份,并与常规板式ELISA作对比。结果 磁珠酶免疫定量检测方法用于人血清Mb定量检测范围可从常 规板式ELISA的5～200μg/L扩展到5～1000μg/L。结论 利用国产磁珠建立的磁珠分离酶免疫定量检测 Mb方法优于常规板式ELISA。

有机硅烷偶联剂对种植义齿固定螺丝孔微渗漏的影响

目的:观察有机硅烷偶联剂在种植义齿固定螺丝孔封闭中的作用;引入并改造一种定量检测固定螺丝孔微渗漏的方法-葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)。方法:制备40个钛合金中空半圆柱状试件(上1/2表面烤瓷,内表面喷砂+酸蚀处理),分为偶联剂处理组与对照组,用Vivadent瓷化树脂粘接后进行对比冷热循环试验。采用GOD-POD法测量微渗漏情况并进行对比。结果:偶联剂组与对照组间的微渗漏具有明显差异(P<0.01)。结论:使用有机硅烷偶联剂可以有效减少固定螺丝孔周壁粘接界面的微渗漏;GOD-POD法是一种能精确测定种植义齿固定螺丝孔微渗漏的简单灵敏的方法。

采用酶偶联体系量热法检测蔬菜中农药残留的实验研究

通过筛选合适的酚氧化酶,与能被农药抑制的鸡肝酯酶组成了可用于农残检测的酶偶联体系。同时采用Micro DSCⅢ量热法,分别针对鸡肝酯酶单酶体系和该酶偶联体系,比较研究了1mg/L的敌百虫溶液和几种蔬菜中的农药残留引起这两种酶体系催化反应放热的变化。结果发现,1mg/L的敌百虫导致酶偶联体系催化反应放热的变化是其导致单酶体系催化反应热量变化的48倍。同时通过抑制率计算分析,发现针对相同样品,采用酶偶联体系,可以获得较高的抑制率响应。

应用酶学旧方法发现新酶

日本 KATATA 报道,传统的微生物筛选方法仍不失为工业上发展新酶的一个重要方法,这已被十一月份召开的 Taniguchi 基金会第七届国际生命科学会议上的情况所证实。日本大阪三得利公司的 Teruo Amachi 描述了一个令人瞩目的发现——一种新的真菌过氧化物酶。这种酶将有可能被生物学家用来做为以过氧化氢偶联反应为基础而进行的测定。过氧化氢氧化还原酶能够偶联过氧化氢和各种底物的能力已经被应用于诊断和实验室研究上,包括免疫吸附分析(ELISAS)、核酸杂交和神经联系示踪等方面。在这些测定中。

基于环糊精和冠醚偶联体系的新型超分子主体模型

超分子化学是当今化学界的前沿学科之一,超分子主体化合物的选择性合成是其一个重要的方面。环糊精与冠醚同为超分子化学中应用广泛的主体分子,各有自己独特的特点及不足,而将二者偶联起来,可得到拥有两个甚至多个识别位点的化合物,可通过协同作用在分子识别、模拟酶、色谱等方面拓展其应用范围,并有较好的效果。本文综述了近年来环糊精与冠醚偶联体系的研究进展:首先介绍了不同种类的环糊精与冠醚偶联体系的合成,包括合成思路、步骤以及方法;然后着重叙述了此体系的应用研究进展,包括其在分子识别、模拟酶、异构体分离以及光能量传导等领域;最后指出目前研究工作仍然存在的不足,并对其前景进行了展望。

(R)与(S)-羰基还原酶偶联一步法制备(S)-苯乙二醇

【目的】通过(R)-和(S)-羰基还原酶在大肠杆菌中偶联,实现了一步法制备(S)-苯乙二醇的生物转化过程。【方法】将来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶基因(rcr)和(S)-羰基还原酶基因(scr)串联于共表达载体pETDuetTM-1上。重组质粒pETDuet-rcr-scr转化稀有密码子优化型菌株Escherichia coli Rosetta,获得酶偶联重组菌株E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-scr。当重组菌体培养至OD6000.6～0.8时,添加终浓度1mmol/L IPTG,30℃诱导蛋白表达10h。【结果】SDS-PAGE结果表明(R)-和(S)-羰基还原酶均明显表达,它们的相对分子质量分别为37kDa和30kDa。重组菌生物转化结果表明:在pH7.0的磷酸缓冲液中,添加5mmol/L Zn2+时,获得产物(S)-苯乙二醇,产物光学纯度为91.3%e.e.,产率为75.9%。【讨论】采用分子重组技术成功整合了两种氧化还原酶的催化功能,实现了(S)-苯乙二醇的一步法转化,为简化手性醇制备途径提供了一条崭新的思路。

(S)-羰基还原酶Ⅱ与葡萄糖脱氢酶共催化高效合成(S)-苯乙二醇

【目的】通过优化获得最佳酶活配比,设计近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ与枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)YX-1葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达体系,实现重组菌高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯乙二醇。【方法】分别从重组大肠杆菌中纯化了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶,研究了2种酶共催化2-羟基苯乙酮的最佳酶活比例,最适催化温度和pH,由此构建(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶的共表达体系。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ的比酶活力为1.3 U/mg,葡萄糖脱氢酶的比酶活力为13.5 U/mg。在总酶活力为1 U时,(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶共催化体系中,确定了2种酶的最佳比例在1∶1到5∶1(U/U)之间,最适反应温度为30℃,pH为7.0。在此基础上构建了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶基因比为1∶1的共表达体系,共表达重组菌破碎上清液中(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶酶活分别为0.76 U/mg和0.73 U/mg,两者的酶活比例为1∶1。在上述确定的最适催化条件下,其催化10 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S)-苯乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与仅含有(S)-羰基还原酶Ⅱ的重组大肠杆菌相比,共表达体系转化产物(S)-苯乙二醇的得率明显提高,且转化时间由原来的24 h缩短为13 h。【结论】通过确定(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶最佳酶活配比,为构建手性催化的靶酶和辅酶再生酶共表达体系,为实现手性化合物的高效制备提供了研究基础。

GOD-POD法在3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗评价中的应用

目的:通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(Glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD)法检测脂肪细胞葡萄糖消耗,建立简便、经济的脂肪细胞胰岛素敏感性的评价方法。方法:诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,分别采用高浓度葡萄糖(25 mmol/L)、地塞米松(Dexamethasone,DEX)(1.0μmol/L)诱导脂肪细胞产生胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR),GOD-POD法测定糖浓度,动态观察诱导过程中细胞糖消耗,并计算胰岛素敏感性指数(Insulin sensitivity index,ISI);同时应用RT-PCR检测脂联素(Adiponectin)mRNA表达。结果:通过该方法检测,可以反映脂肪细胞对葡萄糖的摄取利用,以胰岛素刺激下较基础状态细胞葡萄糖消耗的增加量,计算出ISI,能够反映细胞对胰岛素的敏感性及抵抗程度。结论:GOD-POD法能够准确测定细胞总体葡萄糖消耗,可用于脂肪细胞糖摄取利用与IR评价,此方法操作简便、经济易行。

种植义齿固定螺丝孔微渗漏原因分析

目的:比较4种光固化复合树脂对种植义齿固定螺丝孔的封闭效果,观察有机硅烷偶联剂对固定螺丝孔微渗漏的影响,分析冷热循环试验对固定螺丝孔微渗漏的影响。方法:制备80个钛合金中空半圆柱状试件(上1/2表面烤瓷,内表面喷砂+酸蚀处理),分为偶联剂和非偶联剂组,分别用4种光固化树脂进行封闭,各组再作对比冷热循环试验。用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)测量微渗漏情况,采用SAS 11.10软件包对数据进行方差分析。结果:4种光固化复合树脂间、偶联剂组与非偶联剂组间、冷热循环组与对照组间微渗漏均有显著差异(P<0.01)。在对封闭材料(A因素)、偶联剂处理(B因素)、冷热循环试验(C因素)三因素的交互作用分析中发现,只有B因素与C因素间具有交互作用(P<0.01);AB间、AC间、ABC间则均无交互作用(P>0.05)。结论:封闭材料是影响固定螺丝孔微渗漏的一个重要因素。使用偶联剂可有效减少黏结界面的微渗漏,实验试件对冷热循环试验的耐受性差。