葡萄糖苷酶Ⅰ特异性siRNA-EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建葡萄糖苷酶Ⅰ(glucosidaseⅠ, GluⅠ)特异性siRNA真核表达载体。方法:根据 siRNA靶序列选取原则,设计并合成针对鼠葡萄糖苷酶ⅠcDNA的寡聚DNA,退火并连接至载体 pSilencer1.0 U6,再将 U6 启动子及下游插入片断一起切下,克隆至真核表达载体 pEGFP C1,通过限制性酶切和测序对重组表达载体进行鉴定,最后将该质粒转染至HeLa细胞,共聚焦荧光显微镜观察其表达。结果:①限制性酶切和测序结果表明成功构建了带有EGFP基因的鼠GluⅠ特异性的siRNA真核表达载体 pC 1U6glu; ②共聚焦荧光显微镜观察结果表明p C1U6glu成功转染至HeLa细胞。结论:pC 1U6glu的成功构建及表达为进一步利用 siRNA研究葡萄糖苷酶Ⅰ的功能和治疗肿瘤奠定基础。

绿色木霉BGL Ⅰ基因在酿酒酵母中的克隆表达及其纤维素乙醇发酵

采用反转录PCR方法从绿色木霉AS3.3711的总mRNA中获得了编码β-葡萄糖苷酶Ⅰ(BGLⅠ)的基因bgl1。序列测定表明该基因片段长2 235 bp,编码744个氨基酸残基,与里氏木霉的bgl1序列完全相同。将其插入高拷贝数整合型表达载体PScIKP,构建了重组质粒PScIKP-bgl1。线性化后转化工业酿酒酵母AS2.489菌株,利用高浓度G418筛选高抗转化子,经SDS-PAGE蛋白电泳证明获得了能高效稳定分泌表达重组BGLⅠ的转化子。重组BGLⅠ酶能直接水解培养液中的纤维二糖,在84 h测得酶活最大值为0.978 u/mL。重组BGLⅠ酶最佳反应温度为60℃,最适反应pH为4.0～5.0,并且能以纤维二糖为惟一碳源发酵乙醇,发酵90 h能够用重铬酸钾氧化比色法检测到乙醇的体积分数为0.51%。结果表明:成功克隆并在酿酒酵母中表达了一种高活性的β-葡萄糖苷酶,对于工业上直接利用纤维素为惟一碳源发酵生产乙醇的研究有重要意义。