ste20基因突变抑制葡萄糖诱导的酿酒酵母细胞凋亡(英文)

近年来,酿酒酵母的细胞调亡研究取得了很大进展。多种因素可以诱导其调亡,譬如过氧化氢(H2O2)、醋酸、高渗透压和高盐浓度等。葡萄糖是酿酒酵母生长所必须的重要营养物质之一。同时,在其他营养元素缺乏的条件下,只用葡萄糖培养将迅速的诱导酿酒酵母的细胞凋亡。Ste20是PAK(p21activatedkinase)家族的成员,它参与酿酒酵母的信息素应答、假菌丝生长和侵入生长等途径。有研究表明,ste20突变株能抵抗由信息素和过氧化物诱导的细胞调亡。我们发现STE20基因突变也能抑制葡萄糖诱导的凋亡,用葡萄糖处理时,与野生型相比,ste20突变株细胞能保持完整的细胞膜和细胞核结构。H2O2诱导酿酒酵母细胞凋亡时,需要Ste20激酶磷酸化组蛋白H2B第十号丝氨酸(S10)。因此,葡萄糖诱导的酿酒酵母细胞凋亡作用可能通过类似于过氧化氢诱导的酿酒酵母细胞凋亡的途径进行的。

氨基葡萄糖硫酸盐诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的 探讨氨基葡萄糖硫酸盐(GS)对慢性髓系白血病K 5 62细胞凋亡诱导作用和分子机理。方法 采用台盼蓝拒染法测定细胞生长曲线来观察GS对K5 62细胞的生长抑制作用;取对数生长期K 5 62细胞,在0 .5 ,1.0 ,5 .0mmol/LGS不同浓度作用48h后,利用细胞计数、电镜、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色、DNA梯状电泳、流式细胞仪等方法来观察GS对K 5 62细胞的抑制效应和促凋亡作用。并用Westernblot检测活化的caspase 3和bcl- 2基因的表达。结果 0 .5 ,1.0 ,5 .0mmol/LGS对K 5 62细胞的生长有抑制作用,并呈时间和剂量依赖性(P <0 .0 1)。采用光镜、电镜和AO /EB染色法发现5mmol/LGS作用K 5 62细胞后,出现典型的凋亡形态学改变。AnnexinV染色后流式细胞仪能检测到早期凋亡细胞,细胞周期显示:G1期细胞比例增高,S期比例减低,并有凋亡峰。有明显的梯状DNA。同时GS诱导K 5 62细胞凋亡后出现活化的Caspase 3 ,而Bcl- 2蛋白表达减弱,甚至消失。结论 GS能诱导白血病K- 5 62细胞凋亡,该过程伴有Caspase- 3的活化和Bcl- 2蛋白表达降低。

聚赖氨酸偶联活性氧诱导酿酒酵母细胞凋亡

以酿酒酵母为模式真菌,研究不同致死浓度ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)及其外源添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)共同作用下,细胞生长密度、形态和活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量的变化及其对酿酒酵母活性的影响。结果表明,亚致死浓度处理的细胞不光滑并凹陷,ROS迸发,出现磷脂酰丝氨酸外翻、染色质固缩、线粒体膜电位耗散和DNA损伤的荧光特征,细胞进入凋亡早期阶段。致死浓度处理的细胞粗糙凹陷并凸起,ROS减少,荧光特征明显,细胞进入凋亡后期阶段甚至死亡。添加NAC后,ROS减少,荧光特征降低。因此,说明ε-PL能够诱发ROS上升,使细胞进入凋亡阶段,抑制细胞活性,此外,NAC能够降低ε-PL的抑菌活性。

真菌细胞壁抑制剂刚果红诱导酵母细胞凋亡及其机制研究

以酿酒酵母为研究材料,分析真菌细胞壁抑制剂刚果红(CR)对酵母细胞凋亡的影响及其机制,为植物病原真菌细胞凋亡机制研究提供新的理论依据。结果表明:与正常对照组相比,CR处理后酵母细胞存活率下降、活性氧升高、磷脂酰丝氨酸外翻、细胞核裂解,发生细胞凋亡;外源添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、过表达超氧化物歧化酶基因SOD1和缺失YCA1基因,均可以显著降低CR诱导的酵母细胞凋亡。以上结果说明,CR可以诱导ROS和Yca1p依赖的酵母细胞凋亡。

Bdf1p转录因子BD2和ET结构域双缺失对盐胁迫诱导酵母细胞凋亡的影响

以酿酒酵母为研究材料,分析Bdf1p转录因子BD2和ET结构域双缺失对盐胁迫诱导细胞凋亡的影响。研究结果表明,盐胁迫条件下,与野生型酵母菌株相比,Bdf1p转录因子BD2和ET结构域双缺失体BBDΔ,表现为细胞存活率下降、活性氧升高、细胞核裂解、磷脂酰丝氨酸外翻、细胞凋亡程度加剧,表明Bdf1p转录因子BD2和ET结构域在盐胁迫诱导的酵母细胞凋亡中发挥重要作用。

酿酒酵母凋亡细胞的毛细管电泳行为研究

用醋酸诱导酿酒酵母 (saccharomycescerevisiae)作为细胞凋亡过程 ,用扫描电镜和流式细胞术两种检测技术确证其细胞凋亡特征 :用 80 0mmol/L乙酸诱导 2 1h后的细胞在电镜图上出现明显表面皱缩、细胞壁内陷 ;流式细胞图上出现典型凋亡峰———亚二倍体峰。详细探讨其高效毛细管电泳的行为 ,发现凋亡细胞在3 0 0nm处的强吸收峰消失 ;凋亡细胞核在 2 2 0nm处 ,1 2～ 1 8min之间出现了一个新的分离峰。研究表明 ,毛细管电泳非常适于对细胞凋亡过程进行动态特征监测。

芹菜素7-O-葡萄糖苷对抗TRAIL乳腺癌细胞凋亡的作用机制研究

[目的]探讨芹菜素7-O-葡萄糖苷(AGL)对抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)乳腺癌细胞凋亡的影响。[方法]通过CCK-8法、蛋白免疫印迹、流式细胞法检测AGL、TRAIL、AGL+TRAIL对乳腺癌细胞活性、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)水平和细胞凋亡的影响,通过激光扫描共焦显微镜检测细胞ROS水平,采用ELISA法检测丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及Western-blot检测PARP-1、p53、p53上调凋亡调制物(PUMA)水平。建立MCF7移植瘤模型,观察AGL+TRAIL处理下移植瘤生长和凋亡情况。[结果]TRAIL(50 ng/mL)+AGL(20、40μmol/L)处理时,MCF7细胞存活率降低(P<0.05),Cleaved PARP-1水平升高(P<0.05);TRAIL(50 ng/mL)+AGL(20μmol/L)处理时,MCF7细胞凋亡率、Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9水平均显著升高(P<0.05)。AGL(10、20μmol/L)处理时,MCF7细胞ROS(+)细胞数、MDA水平显著升高(P<0.05),SOD活性显著降低(P<0.05);TRAIL(50 ng/mL)+AGL(20μmol/L)MCF7细胞ROS(+)细胞数目、p53、PUMA、Cleaved PARP-1相对蛋白水平显著高于TRAIL(50 ng/mL)处理(P<0.05),TRAIL(50 ng/mL)+AGL(20μmol/L)+NAC(4 mmol/L)MCF7细胞ROS(+)细胞数、p53、PUMA、Cleaved PARP-1相对蛋白水平显著低于TRAIL(50 ng/mL)+AGL(20μmol/L)处理(P<0.05)。AGL+TRAIL组小鼠移植瘤质量、体积和肿瘤组织p53阳性率、PUMA3阳性率均显著低于Control组(P<0.05),细胞凋亡率显著高于Control组(P<0.05)。[结论]AGL联合TRAIL可促抗TRAIL MCF7细胞凋亡,可能与增强细胞氧化应激损伤和激活Caspase级联反应有关。

2-DG增强TRAIL诱导白血病细胞HL-60凋亡的作用

本研究旨在探讨2-脱氧葡萄糖(2-DG)增强HL-60细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)敏感性的作用及其可能机制。采用MTT法检测不同浓度2-DG、TRAIL对HL-60细胞增殖的影响。选择低于半数抑制浓度(IC50)的10 mmol/L的2-DG和100 ng/ml的TRAIL单独或联合处理细胞,用PI单染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测RIP1、GRP78、PARP蛋白的表达,试剂盒检测caspase-3的活性变化。结果表明,2-DG(10mmol/L)与TRAIL(100 ng/ml)联合作用于HL-60细胞48 h的凋亡率为(45.1±4.3)%,较单用2-DG、TRAIL的凋亡率明显提高(P<0.01),同时二者联合应用能增强GRP78蛋白的表达及caspase-3的活性,下调RIP1蛋白的表达。结论:2-DG能增强TRAIL诱导HL-60细胞的凋亡的敏感性,其机制可能是通过引起过度的内质网应激反应、下调RIP1蛋白的表达以及增加caspase-3的活性。

重组腺病毒IκBαM抑制高糖诱导的血管内皮细胞凋亡

目的 研究NF κB在高浓度葡萄糖 (高糖 )诱导的ECV 30 4血管内皮细胞凋亡中的作用。方法 用携有NF κB抑制物IκBα突变体的IκBαM重组腺病毒 (AdIκBαM)感染ECV 30 4细胞 ,利用WesternBlot、EMSA、电镜、流式细胞仪等检测方法 ,研究NF κB在高糖诱导的血管内皮细胞凋亡中所起的作用 ,以及阻断NF κB活性对血管内皮细胞凋亡及细胞周期改变的影响。结果 高糖能诱导ECV 30 4细胞IκBα的降解和NF κB的激活 ,G0 G1 百分比增加 ,S和G2 M比例下降 ,延缓G0 G1 向S期过渡 ,出现细胞凋亡的形态学改变 ,而感染AdIκBαM的ECV 30 4 IκBαM细胞则能加速G0 G1 向S期过渡 ,未出现细胞凋亡的形态学改变。结论 AdIκBαM能抑制高糖诱导的ECV 30 4细胞NF κB的过度活化及对ECV 30 4细胞的致凋亡作用 ,加速细胞周期转换 ,证实NF

氯沙坦抑制高糖及间歇性高糖诱导NRK-52E细胞凋亡研究

目的:探讨氯沙坦对高糖及间歇性高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E凋亡的抑制作用。方法:作用72h后,分别采用MTT检测NRK-52E细胞活力,细胞凋亡采用流式细胞仪检测Annexin Ⅴ-FITC,细胞ROS含量采用CM2H2DCFDA试剂盒检测。Western blot检测空白组(0 mmol/L)、正常葡萄糖组(5mmol/L)、高糖干预组(25 mmol/L)、间歇性高糖组(5～25 mmol/L交替)、氯沙坦组(10 μmol/L)、高糖氯沙坦组(10 μmol/L氯沙坦预处理后在高糖培养)、间歇性高糖氯沙坦组(10 μmol/L)中凋亡调控标记蛋白Caspase-3及Caspase-9在NRK-52E细胞表达。结果:高浓度葡萄糖及间歇性高糖均上调Caspase-3及Caspase-9表达,细胞活性降低、细胞凋亡率升高,ROS含量显著上升,其中在间歇性高糖作用更显著。应用氯沙坦干预后可以部分下调高糖或间歇性高糖中Caspase-3及Caspase-9表达,细胞凋亡率显著下降,ROS含量下降。结论:氯沙坦可通过抑制高糖及间歇性高糖诱导NRK-52E细胞氧化应激从而减轻细胞凋亡。

D-氨基葡萄糖衍生物对人胃癌细胞系SGC-7901增生的影响

目的:观察D-氨基葡萄糖衍生物体外对人胃癌SGC- 7901细胞增生的影响,探讨其可能作用机制. 方法:采用MTT法,筛选药物作用最佳浓度.用流式细胞仪分析诱导凋亡前后的细胞DNA含量,透射电镜观察凋亡细胞的超微结构.免疫组化测定CD44表达. 结果:D-氨基葡萄糖衍生物能明显抑制胃癌细胞的增长(P<0.01),MTT法显示抑制程度具有时间和剂量效应关系,统计组间比较差异有显著性(P<0.01);流式细胞仪分析可见亚二倍体(Sub-G1)凋亡峰;电镜观察到凋亡细胞的典型变化,免疫组化及光密度检测示CD44表达下降(216.5±7.0 vs 190.0±14.2,P=0.000). 结论:D-氨基葡萄糖衍生物通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制人胃癌SGC-7901细胞增生,同时还有下调CD44的作用.

黄连素抑制GRP78表达促进三阴乳腺癌细胞凋亡的研究

[目的]通过检测黄连素对三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)细胞株MDA-MB-231细胞凋亡及葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)表达的影响,探讨黄连素抗TNBC的机制。[方法]以MTT法检测不同浓度黄连素对MDA-MB-231细胞增殖的影响,筛选黄连素的处理浓度。将MDA-MB-231细胞分为对照组、40μmol·L^(-1)黄连素组、60μmol·L^(-1)黄连素组、免疫球蛋白重链结合蛋白诱导剂X(immunoglobulin heavy chain binding protein inducer X,BiX)组,以及BiX联合40μmol·L^(-1)黄连素组、BiX联合60μmol·L^(-1)黄连素组。相应药物处理24h后,应用流式细胞术检测细胞凋亡情况,并以Western blot检测细胞GRP78和凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达。[结果]40μmol·L^(-1)以上浓度的黄连素可剂量依赖性抑制MDA-MB-231细胞增殖。与对照组比较,BiX组细胞凋亡率降低(P<0.05)、GRP78和Bcl-2表达增高(P<0.01,P<0.001)、Bax表达减低(P<0.05)。与BiX组比较,BiX联合40、60μmol·L^(-1)黄连素组细胞凋亡率增加(P<0.01),GRP78和Bcl-2表达减低(P<0.01,P<0.01),Bax表达增加(P<0.01)。[结论]黄连素可以促进MDA-MB-231细胞凋亡,其机制可能是通过下调GRP78的表达,从而降低Bcl-2表达,并促进Bax的表达。

葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响

目的:观察在不同浓度葡萄糖环境下人成骨肉瘤MG63细胞株肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其护骨素(OPG)、护骨素配体(OPGL)的表达,探讨糖尿病骨质疏松症的发病机制。方法:用不同浓度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)分别刺激培养的MG63细胞24h,采用RT-PCR法检测TRAIL、OPG、OPGLmRNA的表达,以免疫组织化学法检测MG63细胞中TRAIL的表达及分布。结果:不同浓度葡萄糖环境的MG63细胞中TRAIL、OPGLmRNA的表达,均按照对照组、5.5mmol/L组、16.7mmol/L组、33.3mmol/L组的顺序递增(P<0.05),OPGmRNA的表达按照此顺序递减(P<0.05)。33.3mmol/L组TRAILmRNA的水平明显高于对照组[(1.004±0.070)vs(0.740±0.023),P<0.05],TRAIL免疫反应阳性物质密度也明显高于对照组。结论:高糖环境可能导致成骨细胞中TRAIL和OPGL表达增多,OPG表达减少。这可能是糖尿病骨质疏松症的重要发病机制之一。

低氧对无糖逆境中星形胶质细胞增殖和凋亡的作用

目的探讨星形胶质细胞对低氧的耐受程度;葡萄糖对其凋亡和增殖的影响及无糖逆境中低氧微环境对胶质细胞的是否具有保护作用及可能分子机制。方法通过三气培养箱构建低氧微环境,将星形胶质细胞(HAC)设为常氧常糖组(21%O2-G+)和常氧无糖组(21%O2-G-),低氧常糖组(0.1%O2-G+)和低氧无糖组(0.1%O2-G-)。分别在不同培养条件下培养24、48、72 h后通过MTT法及Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡情况,利用Western印迹法检测各组低氧诱导因子(HIF)-1α表达情况。结果在低氧常糖组星形胶质细胞各时间段无明显凋亡(P>0.05),但可缓慢增殖。常氧无糖组及低氧无糖组48 h细胞开始发生明显凋亡,增殖被显著抑制(P<0.05),48 h低氧无糖组细胞凋亡明显低于常氧无糖组(P<0.05),至72 h凋亡率高于常氧无糖组(P<0.05)。低氧可诱导HIF-1α表达水平增高,其中低氧常糖组HIF-1α表达水平最高,其次为低氧无糖组,常氧常糖及常氧无糖组表达量均较低。结论星形胶质细胞可耐受极度低氧;葡萄糖缺乏可诱导细胞发生明显的凋亡并抑制其增殖;低氧可在一定时限内部分对抗葡萄糖缺乏所诱导细胞凋亡。低氧可诱导HIF-1α的高表达,并且可能与低氧抗无糖逆境作用有关。

表达重组人可溶性TRAIL的毕氏酵母发酵工艺

目的优化rhsTRAIL毕氏酵母工程菌在5L发酵罐中的发酵表达工艺参数。方法研究培养基种类、细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并用电镜观察其诱导肿瘤细胞凋亡特征。结果在无机盐培养基中,按10%接种A600=8～12的种菌后,24h酵母菌增殖至A600=76;甘油含量为1%时,菌体生长速度快(A600=160);培养基pH值5.0,甲醇终浓度为1%时,诱导96h表达量最高达到120mg/L,并具有诱导肿瘤细胞凋亡特征。结论rhsTRAIL毕氏酵母的发酵工艺参数为无机盐培养基,pH值5.0,接种10%A600=8～12的种菌,甘油含量1%,甲醇终浓度1%,诱导96h。

波动性高糖诱导大鼠胰岛β细胞凋亡的研究

近年来,胰岛细胞凋亡成为糖尿病研究的一大热点.葡萄糖毒性在糖尿病慢性高血糖状态下可诱导胰岛β细胞凋亡,但以往的研究多集中于慢性持续性高糖的作用,而对于更符合糖尿病患者实际情况波动性高糖的作用报道较少,且具体作用机制不清.因此,我们于2009年7月至2010年4月通过观测大鼠胰岛细胞株（Ins-1）细胞凋亡情况及检测氧化应激相关因子,探讨波动性高糖对胰岛β细胞凋亡的影响及可能机制.

缺氧诱导因子-1α过表达对骨髓间充质干细胞缺氧时生存能力的影响

目的探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)基因转染是否提高缺氧间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的耐缺氧能力以及这种能力是否与增加葡萄糖摄取有关。方法将MSCs分为常氧非转染组(即对照组)、常氧转染组、缺氧非转染组和缺氧转染组,分别于常氧(5%CO2,37℃)和缺氧(94%N2、1%O2和5%CO2,37℃)条件下孵育8 h。免疫细胞化学、RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率(AR)、死亡率(DR),MTT法检测细胞增殖,放射同位素法检测氚标葡萄糖(3H-G)摄取量。结果①与常氧非转染组相比,常氧转染组HIF-1αmRNA表达明显增高(P<0.01),但其蛋白表达2组间差异无统计学意义(P=0.187);与缺氧非转染组相比,缺氧转染组的HIF-1αmRNA和蛋白表达均明显增高(P<0.01)。②缺氧转染组MSCs的AR(P=0.001)和DR(P=0.003)均明显低于缺氧非转染组,但均明显高于常氧非转染组(P<0.01)。③与缺氧非转染组相比,缺氧转染组MSCs增殖(P=0.004)明显提高,但明显低于常氧非转染组(P=0.001)。④与缺氧非转染组相比,缺氧转染组MSCs对3H-G的摄取量明显提高(P=0.004),但明显低于常氧非转染组(P=0.001)。⑤AR与HIF-1α蛋白表达(r=-0.71,P=0.005)3、H-G摄取量(r=-0.65,P=0.004)均呈明显负相关,HIF-1α蛋白表达与3H-G摄取量呈明显正相关(r=0.77,P=0.003)。结论 HIF-1α基因可显著提高MSCs的耐缺氧能力,其机理可能与HIF-1α基因提高MSCs对葡萄糖的摄取有关。