葡萄糖调节蛋白75基因对H_2O_2诱导的C6胶质瘤细胞氧化应激性损伤有保护作用

目的:研究葡萄糖调节蛋白75(grp75)基因对H2O2诱导的C6胶质瘤细胞氧化应激性损伤的保护作用。方法:以grp75基因瞬时转染C6胶质瘤细胞,以H2O2作为氧化应激刺激物,建立细胞损伤模型,运用MTT、LDH、苔盼兰拒染、细胞周期流式细胞术(FCM)和凋亡小体方法观察grp75对H2O2引起的C6细胞氧化应激性损伤的影响。结果:grp75转染组C6细胞在H2O2(0.1mmol/L,24h)刺激后MTT增加、LDH活性降低,细胞凋亡明显抑制,与空载体转染组相比有显著差异。结论:grp75基因对H2O2引起的C6细胞氧化应激性损伤有保护作用。

葡萄糖调节蛋白75在糖尿病肾病发生、发展机制中的作用研究进展

糖尿病肾病(DN)是引起终末期肾功能衰竭的主要病因之一,且会显著增加心脑血管疾病的发病率和病死率~([1])。根据国际糖尿病联合会预测,到2045年全世界糖尿病患者人数将达到7亿人,其中30%~40%患者将发展为DN~([2])。

葡萄糖调节蛋白75对缺糖诱导的凋亡相关基因Bax和NF-κB改变的影响

目的通过已获得稳定表达葡萄糖调节蛋白（Grp75）的PC12细胞株,检测Grp75对缺糖诱导的细胞凋亡过程中Bax和NF-κB的影响。方法Grp75过表达组和对照组细胞无糖培养6h、12h2、4h和48h后,进行相关的实验。免疫印迹法检测缺糖状态下两组细胞中Grp75的表达水平和NF-κB的活性;应用半定量RT-PCR和免疫印迹法比较Bax表达水平的变化;免疫细胞化学通过构象特异性的Bax 6A7抗体检测Bax的活化。结果Bax活化和NF-κB活性的下降在缺糖诱导的PC12细胞凋亡过程中发挥了重要的作用。而Grp75通过阻止Bax的活化和NF-κB活性的下降抑制缺糖诱导的凋亡。缺糖状态下Grp75过表达组和对照组细胞中Bax表达水平均未发生改变。结论Bax活化和NF-κB活性下降与缺糖诱导的PC12细胞凋亡关系密切,Grp75通过阻止Bax的活化和维持NF-κB的活性保护PC12细胞。

葡萄糖调节蛋白75基因突变体及其真核表达载体构建

葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用。为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体。以SOE-PCR(genesplicing by overlap extension)法得到Grp75缺失突变基因,与pcDNA3.0真核表达载体连接,构建Grp75缺失突变的特异性表达载体pcDNA3.0/Grp75(Δ253-282),经酶切、测序鉴定Grp75缺失突变蛋白表达载体成功构建。用脂质体将pcDNA3.0/Grp75(Δ253-282)转染到PC12细胞株,以1mg/mL浓度的G418筛选出稳定株,并命名为PC12/Grp75(Δ253-282)(+)。半定量RT-PCR和Western blot结果显示PC12/Grp75(Δ253-282)(+)细胞组内Grp75的mRNA和蛋白的表达水平较PC12细胞组增高。对PC12细胞组、PC12/Grp75(Δ253-282)(+)细胞组和PC12/Grp75(+)细胞组(pcDNA3/Grp75真核表达载体已构建)分别缺糖0h、3h、9h、18h和36h,MTT法检测各组细胞活力,Hoechst33324法检测细胞凋亡情况。结果显示PC12/Grp75(+)组细胞活力高于其它两组,PC12/Grp75(Δ253-282)(+)组高于PC12组,差异有统计学意义。Hoechst33324染色后,凋亡细胞的比率与MTT细胞活力检测结果基本一致。Western blot检测三种细胞内p53的表达量,PC12/Grp75(+)细胞内p53蛋白表达量低于另外两组,可能是由于Grp75蛋白量的增多部分抑制了p53的表达,提示Grp75对缺糖诱导细胞凋亡的抑制作用部分与p53的结合有关。以上结果表明Grp75基因的缺失突变在一定程度上降低了细胞的活力。

葡萄糖调节蛋白75的表达特性

目的 研究不同条件下葡萄糖调节蛋白 75基因的表达情况。方法 用多组织尼龙膜 (multipletissuenylon ,MTN)Northern杂交显示 grp75在组织中的表达情况 ,用Northern杂交方法研究其在缺糖、氧化磷酸化阻滞剂叠氮钠、Ca2 + 增强剂A2 3187处理后的表达情况。结果 grp75在多组织中都有表达 ,且表达量大致相同 ,在缺糖培养的情况下 ,细胞的 grp75基因明显呈上调表达。高浓度的叠氮钠能够使grp75基因表达大幅度上调 ,A2 3187使grp75的表达量增加。 结论 grp75基因在细胞中有构成性表达 ,能够在多种组织的细胞中发挥作用 ,grp75基因的表达量和细胞自身的能量代谢有关 ,为 grp75基因对细胞缺糖保护提供了证据 ;在grp75表达与调控过程中 ,Ca2 +

银杏叶提取物对帕金森患者血清黑质DMT1、葡萄糖调节蛋白75及神经功能的影响研究

目的探讨银杏叶提取物对帕金森患者血清黑质二价金属离子转运蛋白(divalent metal transporter1,DMT1)、葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75,grp75)及神经功能的影响。方法帕金森患者38例,根据用药不同分为对照组和实验组,每组各19例,对照组患者给予多巴丝肼片,实验组在对照组的基础上给予银杏叶提取物片,治疗连续4周。治疗结束后,对所有患者黑质DMT1、grp75及认知功能进行检测。结果与治疗前相比,治疗后2组患者的黑质DMT1水平较低(P<0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后黑质DMT1水平较低(P<0.05)。与治疗前相比,治疗后2组患者的grp75水平较高(P<0.05),与对照组相比,实验组患者治疗后grp75水平较高(P<0.05)。与治疗前相比,治疗后2组患者的Mo CA评分较高(P<0.05),HAMD评分较低(P<0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后Mo CA评分较高(P<0.05),HAMD评分较低(P<0.05)。结论银杏叶提取物能够显著降低帕金森患者黑质DMT1水平,升高grp75水平,改善认知功能。

沉默葡萄糖调节蛋白75对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响

目的探讨沉默葡萄糖调节蛋白75(GRP75)表达对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响。方法体外培养人肝癌细胞HCCLM3,随机分为对照组、siRNA-1组、siRNA-2组,采用脂质体转染法将siRNA导入siRNA-1组(上游序列5'-GAGACGGUUUCCAAAUGAATT-3',下游序列5'-UUCAUUUGGAAACCGUCUCTT-3')、siRNA-2组(上游序列5'-GCUCUAAGGCUUCCAACCUTT-3',下游序列5'-AGGUUGGAAGCCUUAGAGCTT-3'),对照组不予干扰序列。采用Western blotting法检测各组GRP75表达,采用CCK-8法检测各组转染2、24、48、96 h细胞增殖情况,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组GRP75表达明显降低(P均<0.01),以siRNA-2组降低更明显(P<0.05)。与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组各时点细胞增殖能力均降低(P均<0.01),且以siRNA-2组降低更明显(P<0.01);与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组细胞凋亡率均明显升高(P均<0.01),且siRNA-2组升高更明显(P<0.01)。结论沉默GRP75表达可抑制人肝癌细胞HCCLM3增殖活性,并促进其凋亡。

葡萄糖激酶调节蛋白基因rs1260326多态性与新疆维吾尔族人群2型糖尿病的相关性研究

目的探讨葡萄糖激酶调节蛋白(GCKR)基因rs1260326多态性与新疆维吾尔族2型糖尿病(T2DM)的关系。方法选取2012年6月—2013年3月新疆医科大学第一附属医院确诊为T2DM的维吾尔族患者1 000例为T2DM组,同期选取该院的体检健康者1 008例为对照组。收集所有受试者身高、体质量、臀围、腰围(WC)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)等一般临床资料,计算体质指数(BMI)、腰臀比(WHR)。检测并比较其生化指标〔总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)〕。采用Sequenom Mass ARRAY系统对GCKR基因rs1260326位点进行基因分型,比较T2DM组和对照组GCKR基因rs1260326位点基因型分布及等位基因频率差异;采用Logistic回归分析GCKR基因rs1260326多态性与T2DM的关系。结果 T2DM组BMI、WHR、WC高于对照组(P<0.05);两组SBP、DBP比较,差异无统计学意义(P>0.05)。T2DM组TC、FPG高于对照组,HDL-C、LDL-C低于对照组(P<0.05);两组TG比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两组GCKR基因rs1260326位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05),说明两组样本具有群体代表性。T2DM组与对照组rs1260326位点基因型分布、rs1260326位点等位基因频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic回归分析结果表明,GCKR基因rs1260326隐性遗传模式是T2DM的影响因素(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,入选主效应模型的变量有性别、WHR、TC、TG、HDL-C、GCKR基因rs1260326隐性遗传模式(P<0.05)。结论在新疆维吾尔族中,GCKR基因rs1260326多态性与T2DM相关,TT基因型可能是新疆维吾尔族人群T2DM发生的保护因素。

重庆地区汉族人群多囊卵巢综合征与葡萄糖激酶调节蛋白基因多态性的相关性研究

目的：探讨重庆地区汉族人群葡萄糖激酶调节蛋白（glucokinase regulatory protein,GCKR）基因位点单核苷酸多态性（single lenuclear polymorphisms,SNPs）与多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）及其相关代谢指标的关系。方法：纳入PCOS患者147例,正常对照156例;应用Taqman探针法对研究对象GCKR基因多态性位点rs3817488及rs780094进行基因分型;PCOS组及20例对照人群的胰岛素敏感性用高胰岛素-正葡萄糖钳夹方法评估。结果：PCOS患者GCKR基因位点rs3817588的基因型及等位基因分布频率与正常对照相比无统计学差异（OR=0.929,95%CI=0.541-1.594,χ^2=0.72,P=0.79;OR=0.995,95%CI=0.759-1.304,χ^2=0.00,P=0.97）,同时rs780094位点的基因型及等位基因分布频率与正常对照相比也无统计学差异（OR=1.427,95%CI=0.974-1.598,χ^2=2.74,P=0.10;OR=0.880,95%CI=0.700-1.107,χ^2=1.20,P=0.27）。结论：重庆地区汉族人群GCKR基因位点rs3817588与rs780094的单核苷酸多态性可能与PCOS的发生及相关代谢指标无明显相关性。

缺糖损伤对PC12细胞的效应及对葡萄糖调节蛋白75的表达影响

目的 :探讨缺糖损伤对PC12细胞的效应及对葡萄糖调节蛋白 75 ( grp75 )的表达影响。 方法 :通过形态学观察、MTT法及流式细胞术检测缺糖损伤对PC12细胞活力的影响 ,通过RT -PCR法检测缺糖损伤对 grp75在PC12细胞中表达的影响。结果 :PC12细胞在无糖培养条件下 ,细胞活力逐渐下降 ,48小时后 ,大部分细胞死亡 ,部分细胞为凋亡。而 grp75的表达随着无糖培养时间的增加而上调。 结论 :缺糖损伤导致PC12细胞活力下降 ,并引起

葡萄糖激酶调节蛋白P446L基因多态性与甘肃回族2型糖尿病的关系

目的探讨葡萄糖激酶调节蛋白(GCKR)基因P446L多态性与甘肃回族2型糖尿病(T2DM)的相关性及其对糖脂代谢的影响。方法 T2DM患者178例和正常对照者207例,应用PCR-RFLP检测GCKR-P446L基因型,采用氧化酶法或放免法测定血糖、胰岛素及血脂水平。结果①GCKR基因P446L多态性位点的基因型分布和等位基因频率在T2DM组和正常对照组中的分布存在显著差异,且对照组L446等位基因频率明显高于T2DM组,有显著性差异(基因型:χ2=10.598,P=0.001;等位基因:χ2=6.715,P=0.010)。②L446与P446等位基因携带者相比空腹血糖浓度及胰岛素抵抗指数低而三酰甘油浓度高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GCKR-P446L基因多态性与T2DM、胰岛素抵抗及血脂水平相关,L446等位基因可能是T2DM发生的保护因素之一。

线粒体信号肽引导葡萄糖调节蛋白75-增强型绿色荧光蛋白(GRP75-EGFP)融合蛋白定位于线粒体

目的构建葡萄糖调节蛋白75(GRP75)不同结构域、不同形式突变体与线粒体信号肽重组蛋白并鉴定其亚细胞定位。方法通过重叠延伸PCR,将线粒体靶向信号肽序列分别与GRP75不同结构域基因拼接。利用定点突变PCR分别扩增实现62和65位氨基酸突变的磷酸化失活型、磷酸化激活型突变体、482位氨基酸突变的底物结合缺陷型突变体及三位点同时突变重组体。将上述重组基因克隆入p EGFPC1真核表达质粒,酶切和测序验证后分别用脂质体转染He La细胞,Western blot法检测重组蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察比较重组蛋白亚细胞定位情况。结果成功构建了线粒体信号肽融合或缺失的GRP75结构域、磷酸化失活和激活突变体、底物结合缺陷突变体真核表达质粒。各重组质粒的片段插入、位点突变、信号肽融合情况均符合设计目的,在He La细胞表达后产物的相对分子质量大小均符合预期。EGFP蛋白C端插入信号肽能引导下游融合的GRP75全长蛋白、结构域片段、突变体蛋白表达定位于He La细胞线粒体中,而缺失信号肽的对应重组蛋白则主要分布于胞质和局部核周。结论构建了一系列GRP75重组真核表达质粒,EGFP融合信号肽能引导重组蛋白在线粒体中表达定位。

葡萄糖调节蛋白78基因3'UTR多态性与男性弱精子症的相关性研究

目的:探究葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因3'UTR单核苷酸多态性(rs12009、rs1140763和rs16927997位点)与弱精子症的关系。方法:选取400例弱精子症不育男性为弱精子症组,400例有生育史的健康男性为对照组,运用多重单碱基延伸PCR(SNa Pshot)对所有研究对象GRP78基因的rs12009、rs1140763和rs16927997位点进行基因分型,再分析此3个位点多态性与男性弱精子症的相关性。结果:弱精子症组和对照组的前向运动精子百分率分别为(20.09±8.18)%、(57.16±13.45)%,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。GRP78基因rs12009和rs1140763存在CC、CT、TT 3种基因型和C、T 2种等位基因;rs16927997存在GG、GA、AA 3种基因型和G、A 2种等位基因。在弱精子症组中,rs12009位点C、T等位基因频率分别为47.3%、52.7%;rs1140763位点C、T等位基因频率分别为52.0%、48.0%;rs16927997位点G、A等位基因频率分别为4.4%、95.6%。而在对照组中,rs12009位点C、T等位基因频率分别为44.3%、55.7%;rs1140763位点C、T等位基因频率均为50.0%;rs16927997位点G、A等位基因频率分别为6.0%、94.0%。3个位点基因型及等位基因频率在弱精子症组和对照组中的分布差异均无统计学意义(P>0.05);进一步单倍型分析,发现在弱精子症组和对照组中主要为C-C-A、T-C-G、T-T-A 3种单倍型,但也未发现单倍型与男性弱精子症存在相关性。结论:GRP78基因3'UTR多态性与男性弱精子症的发病风险不存在相关性。

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在乳腺癌细胞(231)侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体,转染入231细胞,利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况;并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞;反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因,下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。

ChRBP在葡萄糖和多不饱和脂肪酸调控肝脏基因表达中的作用

近年研究发现,碳水化合物调节元件结合蛋白(ChR BP)在多不饱和脂肪酸和葡萄糖调节糖酵解和生脂基因的表达中作为一种关键的转录调控因子发挥着重要的作用。本文将综述葡萄糖和多不饱和脂肪酸调控肝脏中编码代谢相关酶基因表达的具体机制同时,阐述ChR BP在该机制中扮演的角色。

葡萄糖调节蛋白75对棕榈酸诱导的MIN6细胞脂毒性的影响及机制研究

目的探讨葡萄糖调节蛋白75(Mortalin)对棕榈酸诱导的MIN6细胞脂毒性的影响和机制。方法无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6J小鼠,20只,6~8周,20~24 g。采用随机数字表法将小鼠分为标准饮食组(SD)和高脂饮食组(HFD),每组10只。使用免疫荧光染色法、免疫组织化学法检测小鼠胰腺组织中Mortalin的表达情况。通过慢病毒转染构建Mortalin敲低(Sh-Mortalin)的MIN6稳转细胞株,根据使用牛血清白蛋白(BSA)还是棕榈酸(PA)处理敲低和空载细胞将其分为Sh-Mortalin组、Mortalin敲低空载组(ShNC-Mortalin组)、Sh-Mortalin+PA组、ShNC-Mortalin+PA组,按应用细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂U0126还是二甲基亚砜(DMSO)将细胞分为Sh-Mortalin+DMSO组、Sh-Mortalin+PA+DMSO组、Sh-Mortalin+U0126组、Sh-Mortalin+PA+U0126组。使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和活性氧(ROS)水平,酶联免疫吸附测定法检测胰岛素水平,Western blotting检测ERK通路相关蛋白[磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶-1(p-Raf-1)]的表达。2组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果体内实验结果表明,与SD组相比,HFD组小鼠胰腺的Mortalin表达明显增加(P<0.01)。体外实验结果表明,与ShNC-Mortalin+PA组相比,Sh-Mortalin+PA组的细胞增殖水平更高,细胞凋亡率更低,细胞ROS水平更低,胰岛素水平更高(P<0.05)。Western blotting结果显示,ShNC-Mortalin和Sh-Mortalin组p-ERK1/2、p-Raf-1蛋白表达均以PA时间梯度降低,且与ShNC-Mortalin组相比,Sh-Mortalin组的p-ERK1/2蛋白水平更高(P<0.05)。与Sh-Mortalin+DMSO组相比,Sh-Mortalin+U0126组EdU阳性率和p-ERK1/2水平均更低,且细胞脂毒性损伤加重(P<0.05)。结论Mortalin参与调控了MIN6细胞的脂毒性损伤过程,且敲低Mortalin可通过激活Raf-1/ERK信号通路减轻PA诱导的MIN6细胞脂毒性损伤。

以葡萄糖激酶为靶点治疗2型糖尿病的实验研究进展

目的探讨以葡萄糖激酶为靶点治疗2型糖尿病药物的研究现状。方法参阅国内外发表的相关文献,综述葡萄糖激酶激活剂、葡萄糖激酶调节蛋白以及突变的葡萄糖激酶基因对2型糖尿病治疗的效果及影响。结果 3种方法均能不同程度地调节2型糖尿病动物的血糖水平,但其具体作用机制及其副作用有待进一步研究。结论以葡萄糖激酶为靶点来调控血糖水平可能是一种安全有效的措施。

电针预处理对全脑缺血再灌注损伤大鼠海马葡萄糖调节蛋白78和生长停滞及DNA损伤基因153表达的影响

目的:探讨电针预处理对短暂性全脑缺血再灌注大鼠海马葡萄糖调节蛋白78(GRP 78)和生长停滞及DNA损伤基因153(GADD 153)表达的影响。方法:SD大鼠随机分为假手术组、缺血组和电针预处理组,每组48只。采用四血管阻断法建立全脑缺血再灌注模型。电针预处理组于模型建立前5d电针刺激"大椎""百会"两穴,30min/d。分别于再灌注6、12、24、48h处死动物。Western blot方法检测海马GRP 78和GADD 153表达;HE染色法计数存活神经元数目;TUNEL法测定凋亡神经元数目。结果:与假手术组相比,缺血组再灌注12、24、48h海马存活神经元计数减少,各时点凋亡神经元数目增多(P<0.05),缺血组在再灌注6、12、24、48h海马GRP 78和GADD 153表达上调(P<0.05);与缺血组比较,电针预处理组再灌注24、48h时海马存活神经元计数升高,在12、24、48h凋亡神经元数目减少(P<0.05),再灌注各时点GRP 78表达上调,GADD 153表达下调(P<0.05)。结论:电针预处理对缺血再灌注大鼠有显著的脑保护作用,这可能与其上调脑缺血区GRP 78表达,下调GADD 153的表达,从而减轻内质网应激反应有关。

葡萄糖激酶调节蛋白基因rs780094多态性与儿童青少年血脂关系的研究

目的：探讨葡萄糖激酶调节蛋白（GCKR）基因rs780094的多态性与儿童青少年血脂水平的关系。方法选取1026名7～18岁中小学生为研究对象。由专职人员记录学生一般情况和既往病史，检测身高、体重，并采集清晨空腹肘静脉血，测定血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。利用基质支持的激光释放/电离飞行时间质谱分析（MALDI-TOF MS）进行GCKR基因rs780094位点的基因型检测。采用多元线性回归和多元logistic回归分析基因多态性与血脂水平的关系。结果调整年龄、年龄的平方和性别，GCKR基因rs780094多态性A等位基因与TC、TG和LDL-C的水平增加存在相关性（b＝0.06 mmol/L，P＝0.037；b＝0.09 mmol/L，P＜0.001；b＝0.05 mmol/L，P＝0.040）；rs780094多态性与TG、LDL-C异常也存在相关性（OR＝1.60，95%CI：1.30～1.97，P＜0.001；OR＝1.35，95%CI：1.02～1.80，P＝0.036）。结论 GCKR基因rs780094位点的多态性与儿童青少年血脂水平有关，A等位基因可能是血脂增高的遗传因素。