过表达果糖脱氢酶促进氧化葡萄糖酸杆菌高效合成5-酮果糖

5-酮果糖(5-KetoFructose,5-KF)具有与D-果糖相似的甜度和自然甜味,且不能被人体代谢而具有低热量的优点,是一种具有发展前景的非营养型天然甜味剂。为了获得5-酮果糖高产菌株,作者将来源于Gluconobacter japonicus的膜结合的果糖脱氢酶基因在Gluconobacter oxydans中过表达,通过对不同的宿主、表达载体和启动子的筛选,获得一株能够高效合成5-KF的工程菌QT-10。在3 L发酵罐中进行补料发酵优化,最终采用恒速连续流加果糖的方式,该工程菌可在82 h内消耗质量浓度为650 g/L的D-果糖,5-KF的产量高达608 g/L,产率为94.6%,时空产率为7.41 g/(L·h)。

生物催化肌醇生产葡萄糖醛酸转化体系的构建与优化

葡萄糖醛酸(D-glucuronic Acid),由于其良好的解毒性能,广泛应用于医药、保健、食品及医美领域。随着合成生物学的高速发展,利用工程菌生产葡醛酸的生物发酵法取代化学合成成为一种趋势。研究结果表明:最佳诱导条件为在OD_(600)为0.5时,培养基中加入0.2 mmol/L的IPTG,26℃诱导8 h,构建的重组菌株BL21/pETDuet-miox可以实现肌醇氧化酶(MIOX)的高效表达;然后将肌醇氧化酶载体质粒pETDuet-miox转化进不同的表达宿主中,根据转化产量最佳表达宿主为Escherichia coli Rosetta(DE3);以肌醇氧化酶作为催化剂催化肌醇生产葡萄糖醛酸的最佳催化形式为冷冻破壁后菌体;得出最佳催化条件为在pH值为7.5的MOPS缓冲体系中,催化温度30℃时,对菌体添加量选择100 g/L湿菌体,底物质量浓度选定2 g/L。在此条件下肌醇转化率80.3%,葡醛酸产量达到1.606 g/L。本项研究为葡萄糖醛酸生物合成提供新的方法,也为葡醛酸的低成本工业化生产奠定基础。

混合培养中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌的作用

为查明维生素C二步发酵混合培养中巨大芽孢杆菌与氧化葡萄糖酸杆菌间的关系,通过生长曲线测定、静息细胞实验及摇瓶发酵实验研究了巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产生2酮基L古龙酸作用的影响;采用超滤分离、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对巨大芽孢杆菌胞外液中具有促进氧化葡萄糖酸杆菌产酸作用的活性物质进行了分离和纯化.结果表明,大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长,大菌胞外液中具有该作用的组分分子量在100KDa以上;大菌胞外液具有促进小菌转化L山梨糖生成2酮基L古龙酸的作用,其胞内液无该作用;大菌胞外液中具有该活性作用的组分为30～50KDa和大于100KDa两个部分.其中30～50KDa范围的大菌胞外液中的活性组分为一种蛋白质,其表观分子量约为35KDa,由一种亚基构成。

维生素C二步发酵中巨大芽孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸的影响

通过测定氧化葡萄糖酸杆菌转化L－山梨糖中成ZKGA的细胞酶活性、摇瓶发酵及中长变化，研究了Vc:步发酵中巨大茅孢杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸作用的影响。结果显示：巨大芽孢杆菌胞外液和胞内液均可促进氧化葡萄糖酸杆菌的增殖，主要表现为缩短其中长周期中的延迟期；巨大芽孢杆菌通过所产生的部分生物活性物质增强氧化葡萄糖酸杆菌产酸的细胞酶活性，促进氧化葡萄糖酸杆菌转化L一山梨糖生成2KGA.

离子注入氧化葡萄糖酸杆菌的诱变效应

本文运用离子注入对维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的产生菌氧化葡萄糖酸杆菌的诱变效应进行了研究,确立了以8%甘油作保护剂,并就低能离子注入条件进行了参数设定。

氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞转化乙二醇制备乙醇酸

考察了利用氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞转化乙二醇制备乙醇酸的工艺过程。在分批转化的条件下,100 g/L的乙二醇溶液经过30 h左右的反应,生成118.5 g/L的乙醇酸,转化率达到97%以上,静息细胞可以连续使用3个批次,平均转化率达到93.3%。通过补料分批转化,可以进一步的提高产量,经过38 h的反应得到182.5 g/L的乙醇酸,大大提高了转化液中的产物浓度。

几种外源物质对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2-酮基-L-古龙酸的影响

通过在发酵培养基中添加不同的外源营养物质及巨大芽孢杆菌的培养上清液,研究其对氧化葡萄糖酸杆菌生长及产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)的影响。结果表明,添加适量的谷氨酸单钠(MSG)、腺苷三磷酸(ATP)、含氮碱基、二氢叶酸和巨大芽孢杆菌的培养上清液都能够促进菌体增殖并提高2-KGA产量,而且2-KGA产量与生物量呈正相关。巨大芽孢杆菌的培养上清液促进菌体生长和产2-KGA的作用远大于以上各种外源营养物质。添加培养36 h的巨大芽孢杆菌胞外液后,氧化葡萄糖酸杆菌的菌落数和2-KGA产量分别是对照的13.39倍和8.81倍,而添加外源营养物质中促进作用最大的二氢叶酸后仅为对照的4.12倍和2.97倍。这表明,2-KGA产量的增加主要是通过促进氧化葡萄糖酸杆菌的菌体增殖实现,巨大芽孢杆菌的培养上清液促进氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸的机制不同于其他外源营养物质,可能是通过某种生物活性物质提高氧化葡萄糖酸杆菌菌群密度来实现。

氧化葡萄糖酸杆菌的固定化及在鼓泡式反应器中制备乙醇酸

考察了包埋法固定氧化葡萄糖酸杆菌的过程,并且研究了利用该固定化细胞在鼓泡塔生物反应器中转化乙二醇制备乙醇酸。固定化的最优条件为:聚乙烯醇的最佳质量分数为8%,海藻酸钠为0.8%,最适湿细胞包埋量为每毫升凝胶0.27 g。固定化细胞对酸碱的抗性和热稳定性均较游离细胞有所提高。利用固定化细胞在鼓泡式反应器中转化乙二醇制备乙醇酸,在乙二醇质量浓度70 g/L的条件下,首批转化率达到92.6%,并且可以实现连续转化6个批次,平均转化率在85%以上。

氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究

通过超速离心收集膜组分、表面活性剂溶解膜蛋白、CM-纤维素柱层析纯化等步骤,从氧化葡萄糖酸杆菌DSM2003中获得电泳纯的具有1,2-丙二醇脱氢酶活性的脱氢酶,此酶由两个亚基组成,其表观相对分子质量分别为80000和50000。经MALDI-TOFMS-MS质谱分析与肽质量指纹图谱检索鉴定,证明纯化得到的酶是乙醇脱氢酶。酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为30℃,最适pH值为5.5～6.0;该酶能催化多种一元醇、二元醇,但对包含3个以上羟基的多元醇基本无氧化活性;其催化活性随着底物碳链长度的增加而减小;大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA等)对此酶活性均有抑制作用。

氧化葡萄糖酸杆菌原生质体的形成和再生研究

报道氧化葡萄糖酸杆菌原生质体的形成和再生的方法。将最佳生长条件下对数生长后期的培养物以溶菌酶处理,YE培养基上再生原生质体、原生质体形成率约99%,再生率2.93%。

氧化葡萄糖酸杆菌驯化选育及其产二羟丙酮

通过梯度增加种子培养基中甘油浓度驯化氧化葡萄糖酸杆菌(Cluconobater oxydans),有效地提高了该菌对甘油的耐受性,菌株产二羟丙酮水平比驯化前提高了29%,在此基础上,采用单因素试验,对其发酵工艺进行优化。考察甘油质量浓度、酵母膏质量浓度、CaCO_3质量浓度、接种量对发酵的影响,结果显示最佳工艺条件为:甘油质量浓度为60 g/L,酵母膏质量浓度为5 g/L,CaCO_3质量浓度为10 g/L,接种量4%,在此条件下,经72 h摇瓶发酵甘油转化率达96%,二羟丙酮产量可达57.4 g/L,7.5 L发酵罐分批发酵54 h时甘油转化率达97%,二羟丙酮产量可达58.2 g/L。

氧化葡萄糖酸杆菌的选育及其发酵条件优化

目的提高氧化葡萄糖酸杆菌的生物量。方法采用紫外诱变育种、梯度平板半理性设计筛选、单因素实验进行培养条件优化、2 L发酵罐内进行补料培养。结果筛选到了一株生物量高产菌株,命名为Gouv2007,其生物量比原始菌株提高了11.2%,脱氢酶比酶活与原始菌株持平,培养时间缩短了6 h。该菌生长的最佳碳源为山梨醇,氮源为酵母粉,无机离子为硫酸镁和磷酸氢二钾;最佳培养条件为:培养温度28℃,500 mL烧瓶装液量100 mL、摇床转速200 r/m in、培养基的初始pH自然。在最佳条件下培养,其生物量为1.34 g/L,比原始菌株提高了50.6%,脱氢酶比酶活有所提高。在2 L发酵罐内补料培养,其生物量达到了5.58 g/L。结论通过紫外诱变育种和条件优化提高了该菌的生物量,并在发酵罐内进行了小试。

氧化葡萄糖酸杆菌及其伴生菌软化芽孢杆菌原生质体融合的研究

经紫外线单亲灭活的软化芽孢杆菌Bacillus macerans 30-6原生质体和氧化葡萄糖酸杆菌Glucunobacter oxydans 10-3原生质体在PEG(MW6000)诱导下进行融合。在含利福平的YE再生培养基上筛选融合子,融合频率为2.8×10^(-7)。

氧化葡萄糖酸杆菌酶学和分子生物学研究

对氧化葡萄糖酸杆菌初级代谢途径中的关键酶及分子生物学研究做了系统的评述 ,展望了分子技术改造氧化葡萄糖酸杆菌和优化 2 KGA代谢途径的可能。

氧化葡萄糖酸杆菌培养及生物转化性能的研究

对氧化葡萄糖酸杆菌在山梨醇培养基中的生长及其静息细胞对山梨醇的氧化做了动态研究。实验结果表明:作为碳源的山梨醇对该菌的生长具有明显的抑制作用,当山梨醇的浓度为2%时,该菌生长最好,底物利用率高。当装液量为20ml时,该菌静息细胞浓度为1.0mg干细胞重/ml时,转化效果最好,34h产物收率就达到77%,当装液量为10ml时,该菌静息细胞浓度为2.0mg干细胞重/ml时,转化效果最好,16h产物收率就达到90%。另外,在该菌的生长和其静息细胞转化山梨醇时,都不加入镁离子,该菌静息细胞对山梨醇无转化。

甘油诱导氧化葡萄糖酸杆菌山梨醇脱氢酶

在山梨醇培养基中,梯度增大甘油质量浓度诱导提高氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞山梨醇脱氢酶活力。当甘油质量浓度为20 g/L时,山梨醇脱氢酶的比酶活达到114 U/mg,比未用甘油诱导的提高了67%。甘油诱导后的山梨醇脱氢酶对山梨醇的亲和力增加至1.34倍(Ks从51 mmol/L变为38 mmol/L);同时其储存稳定性提高,用甘油诱导的菌体静息细胞储存30 d后,其山梨醇脱氢酶比酶活是新制备菌体静息细胞的75%,未诱导的只有30%。该工作的新颖性已为陕西省科学技术信息研究所科技查新中心2008年9月18日出具的第2008729号《科技查新报告》所证实。

氧化葡萄糖酸杆菌培养及转化1,2-丙二醇生产D-乳酸研究

对氧化葡萄糖酸杆菌培养及转化1,2-丙二醇生产D-乳酸进行研究。采用单因素实验优化了氧化葡萄糖酸杆菌的生长培养基,然后通过不同转化条件对该菌转化1,2-丙二醇生成D-乳酸的工艺进行了初步探讨。氧化葡萄糖酸杆菌生长的最佳碳源为6%山梨醇、最佳氮源为3%酵母粉;转化1,2-丙二醇的最优工艺为:10%静息细胞、20%(R,S)1,2-丙二醇维持pH6.0,250mL摇瓶装液30mL,28℃、220r/min培养30h。

VC二步发酵产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌的选育

实验通过紫外线两轮诱变的方法诱变选育氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans),以实现提高2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)产量的目的,获得1株高产2-KLG的菌株G5。结果证明该突变菌株在pH6.5-6.7的发酵培养基中与蜡质芽孢杆菌(Bcilluscereus)混合发酵,G5的平均糖酸转化率提高了13.49%,酸量达到83.6mgmL,发酵周期缩短了2-3h。经连续10代转接发酵实验,证明其产酸稳定性较好。结论:氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)的突变体G5提高了糖酸转化率,缩短了发酵周期。

维生素C混菌发酵中地衣芽胞杆菌对氧化葡萄糖酸杆菌伴生活性的研究

对维生素C混菌发酵中地衣芽胞杆菌的伴生活性进行了研究。分别对单独培养、混合培养条件下地衣芽胞杆菌的生长特性进行分析,并以氧化葡萄糖酸杆菌的生长密度、产酸量为指标,考察地衣芽胞杆菌胞外液的伴生活性以及蛋白酶抑制剂对活性的影响。结果表明,活性物质在地衣芽胞杆菌对数生长期阶段合成并释放至胞外,使胞外液上清对氧化葡萄糖酸杆菌的生长和产酸产生促进作用。随着伴生菌培养时间的延长,其胞外上清活性也逐渐提高,18 h胞外液活性达到最高。蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟,PMSF)对胞外液活性并没有表现出抑制作用,可能没有参与伴生过程。

氧化葡萄糖酸杆菌SCB329基因组的大小与结构的研究

收集维生素C产生菌氧化葡萄糖酸杆菌GluconobacteroxydansSCB32 9的纯培养对数期的菌体 ,采用凝胶包埋法制备完整染色体 ,用稀有酶切位点的限制性内切酶和脉冲场电泳技术对SCB32 9的基因组进行了分析 ,SpeⅠ (5′ ACTAGT)酶切有 2 4个片段 ,其大小从 1 0kb到32 0kb,用XbaⅠ (5′ TCTAGA)酶切产生 40个片段 ,其大小从 4kb到 2 0 0kb,综合两种限制酶酶切片段长度的总和结果 ,SCB32 9基因组大小为 2 70 0kb,SCB32 9基因组由一条 2 50 0kb的染色体和一个 2 4 5kb的质粒组成。通过用脱氧核糖核酸酶Ⅰ和S1核酸酶处理其基因组后电泳证实SCB32