黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶提取工艺、酶学性质、实际应用研究

目的研究黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶(sbslGUS)提取工艺、酶学性质、实际应用。方法在单因素试验基础上,以粒度、加水量、提取时间、提取次数为影响因素,酶活性为评价指标,正交试验优化提取工艺。分析底物(黄芩苷)浓度与酶解速度的关系,计算V_(max)、K_(m),考察pH值、温度、金属离子对酶活性的影响,评价pH稳定性、热稳定性。sbslGUS酶解黄芩苷以制备黄芩素,考察pH值、温度、反应时间、底物初始浓度、加酶量对转化率的影响。结果最优提取工艺为粒度40目,加水量10倍,提取时间15 min,提取次数3次。酶解符合酶促反应动力学,K_(m)为0.0063 mol/L,V_(max)为70.42μmol/h,在pH值6.0、温度45℃、金属离子100 mmol/L Cu2+下酶活性最强,sbslGUS在pH值4.0~7.0、温度4~30℃范围内稳定性良好。最优制备工艺为pH值6.0,温度45℃,反应时间12 h以上,底物初始浓度67.2 mmol/L,加酶量1 mL/0.269 mmol黄芩苷,转化率为97.83%。结论sbslGUS酶解效率高,条件温和,可为获取黄芩素提供简便的制备方法,并且拓展了黄芩茎叶应用途径。

黄芩葡萄糖醛酸水解酶基因的克隆、生物信息学分析及表达

该文从黄芩叶中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了葡萄糖醛酸水解酶基因(sbGUS)的全长(Gene Bank登录号KR364726)。该基因全长1584 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码527个氨基酸,为不稳定亲水蛋白。生物信息学分析结果显示sbGUS编码蛋白分子质量为58.724 8 kDa,等电点pI5.55,含有信号肽和1个跨膜区,具有1个水解酶超级家族结构域1个未整合的转移糖苷酶催化结构域。二级结构中α-螺旋(Alpha helix)占25.62%,延伸链(extended strand)占28.84%,β-转角(Beta turm)占13.28%,无规卷曲(random coil)占32.26%。序列比对和系统进化分析表明,sbGUS基因与黄芩(BAA97804.1)核苷酸相似性为98.93%、氨基酸相似性为98.29%,在9个位置氨基酸不同。实时荧光定量PCR检测sbGUS在根中表达丰度最高,其次为花和茎,在叶中表达量最低。这为进一步鉴定sbGUS的功能及开展黄芩素的合成生物学研究奠定基础。

酶法制备野黄芩素的工艺研究

目的应用黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶(Scutellaria baicalensis stems and leaves glucuronic hydrolase,sbsl GUS)酶解灯盏花中野黄芩苷制备野黄芩素,经分离纯化获得高纯度的野黄芩素提取物。方法采用正交试验优选灯盏花提取工艺参数;以野黄芩苷酶解转化率为指标,对酶用量、酶解pH值、温度、时间、抗氧化剂等进行考察,优选野黄芩素制备工艺参数;采用乙醇提取、活性炭脱色和分步结晶精制纯化粗提物。结果灯盏花提取工艺为灯盏花切段,加10倍水煎煮提取2次,每次1 h。野黄芩素制备工艺为sbsl GUS提取液和灯盏花水煎液加入量(以生药计)比为1∶10,加0.5%偏重亚硫酸钠,酶解pH值约6.0,温度约45℃,时间20 h,得到含量大于60%的野黄芩素粗提物。经分步结晶对粗提物进行纯化,用80%乙醇回流提取,活性炭脱色,浓缩、析晶,得到含量大于85%的野黄芩素提取物。结论该工艺应用sbsl GUS酶解技术制备野黄芩素,生产简便可行,为野黄芩素的生产制备提供了新的途径。