BDNF参与保护葡萄糖饥饿引起的微血管内皮细胞凋亡

目的:探讨脑源性神经营养因子(BDNF)是否参与葡萄糖缺乏状态下微血管内皮细胞的保护。方法:使用小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3细胞株构建葡萄糖饥饿模型,分别使用BDNF的siRNA及BDNF-TrkB通路阻断剂对经建模的微血管内皮细胞进行处理,使用流式细胞技术检测细胞凋亡,使用Western blot和qRT-PCR分别对BDNF及其他调控基因的表达进行研究。结果:葡萄糖饥饿会导致微血管内皮细胞凋亡,晚期凋亡水平随着缺糖时间增加而升高,且微血管内皮细胞BDNF表达量上调。在葡萄糖饥饿状态下,使用BDNF受体TrkB的抑制剂K252a阻断BDNF-TrkB通路能增加微血管内皮细胞的早期凋亡;抑制BDNF表达使微血管内皮细胞的凋亡升高。结论:BDNF参与保护葡萄糖饥饿引起的微血管内皮细胞凋亡,并参与非葡萄糖饥饿和葡萄糖饥饿状态下糖酵解关键调控基因PFKM表达水平的维持,从而在维持血管内皮细胞的存活及通过糖酵解供能中发挥重要的调控作用。

葡萄糖饥饿对HeLa细胞形态与结构的影响

为了探究葡萄糖饥饿对HeLa细胞形态与结构的影响,采用噻唑蓝法检测了细胞活力;用倒置显微镜、荧光显微镜和电子显微镜观察了细胞形态与结构的变化;采用激光共聚焦免疫荧光技术观察了细胞微丝与微管的分布.结果表明:葡萄糖饥饿能够抑制HeLa细胞增殖,破坏细胞骨架,改变细胞形态;使细胞皱缩、染色质凝集,出现凋亡小体,微丝微管解聚,表现出典型的凋亡特征,且细胞凋亡程度呈葡萄糖浓度依赖性和处理时间依赖性.总之,葡萄糖饥饿能抑制HeLa细胞活性,改变细胞形态,诱导细胞凋亡.

葡萄糖饥饿对胃癌细胞MMP-2、MMP-9表达的影响及意义

目的探讨葡萄糖饥饿对胃癌AGS和MKN28细胞MMP-2、MMP-9表达的影响及意义。方法胃癌细胞AGS和MKN28在含不同葡萄糖浓度(5mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L、0.05mmol/L、0mmol/L)培养液中培养24h后,Westernblotting检测细胞内MMP-2、MMP-9蛋白表达变化,荧光定量PCR检测MMP-2、MMP-9mRNA表达变化,明胶酶谱实验检测细胞培养上清中MMP-2、MMP-9活性。CCK-8检测在葡萄糖饥饿环境下外源性脯氨酸(5mmol/L)对胃癌细胞活力的影响。结果随着培养液中葡萄糖浓度降低,胃癌细胞内MMP-2和MMP-9在蛋白水平和转录水平呈浓度梯度依赖上调,且在葡萄糖完全缺乏条件下表达上调达到最大。对培养液上清中酶活性检测呈相同趋势。与未添加脯氨酸组相比,外源性添加脯氨酸(5mmol/L)可改善葡萄糖饥饿环境下胃癌细胞活力,这一效应在12h达到最大。结论葡萄糖饥饿可促使胃癌细胞内MMP-2和MMP-9表达及酶解活性增强,加剧细胞外基质中胶原分解代谢,而细胞外游离脯氨酸可支持乏营养肿瘤微环境下胃癌细胞的存活。

不同寡营养条件下饥饿期粪肠球菌基因转录水平的体外研究

目的:在体外模拟根管致病压力条件下,探究不同寡营养条件对饥饿期粪肠球菌基因转录水平的影响。方法:将粪肠球菌标准菌株(ATCC 29212)诱导至饥饿期后培养于不同寡营养条件下(0%、0.05%、0.15%和0.25%葡萄糖浓度的培养液),1周后对其基因转录水平及代谢通路进行分析。结果:转录组结果显示,与0.25%相比,0.15%葡萄糖浓度基因转录水平没有明显变化,0.05%及0%葡萄糖浓度基因转录水平变化明显,以0%葡萄糖浓度变化最为显著,在GO功能上,显著富集于代谢进程及催化活性,在KEGG功能上并无显著差异,排名前3的代谢通路有ABC转运器、磷酸转移酶系统、氨基酸生物合成。结论:寡营养条件下,粪肠球菌基因转录水平的变化可能和其在恶劣生存条件下仍能生存和致病有关,在本研究基础上将进一步探究粪肠球菌相关功能基因和调控通路在致病过程中的机制。

重组人酸性成纤维细胞生长因子改构体发酵的补料-分批策略研究

人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的细胞具有广泛生物学活性的细胞生长因子。研究了乙酸浓度对重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)改构体表达体系Escherichia coliBL21(DE3)/pET3C-haFGF的生长和表达的影响,探索了几种高密度培养重组大肠杆菌的流加分批发酵技术。通过比较几种不同的补料策略间歇流加、间歇-静态DO平衡、静态溶氧平衡-葡萄糖饥饿法、静态pH,有效的避免了发酵过程中,尤其是诱导表达阶段乙酸的积累。菌体密度OD600nm=22左右,可溶性重组人酸性成纤维细胞生长因子纯化后水平为450mg/L。

人腺苷酸活化蛋白激酶5基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对人胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的探讨人腺苷酸活化蛋白激酶5（ARK5）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体的构建及其对人胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响。方法以人ARK5mRNA编码序列为干扰靶点，设计3条沉默ARK5的特异性短发卡RNA（shRNA），构建重组慢病毒表达载体，转染人胃癌SGC7901细胞。采用实时荧光定量PCR和Westernblot检测ARK5基因的沉默效果，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell法检测细胞侵袭能力，流式细胞仪检测葡萄糖饥饿和肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导处理对细胞凋亡的影响。结果测序结果证明，RNAi重组慢病毒载体ARK5-shRNA-3构建成功。实时荧光定量PCR检测显示，正常对照组、阴性对照组和ARK5-shRNA-3转染组的ARK5基因表达水平分别为1．002±0．082、1．001±0．050和0．140±0．003。ARK5．shRNA-3转染组与正常对照组、阴性对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。细胞划痕实验显示，ARK5-shRNA-3转染组的细胞迁移率为（38．5±4．3）％，而正常对照组和阴性对照组的细胞迁移率分别为（72．4±6．4）％和（75．1±7．1）％，差异有统计学意义（P〈0．01）。Transwell检测结果显示，正常对照组、阴性对照组和ARK5-shRNA-3转染组的穿膜细胞数分别为（257．4±12．3）个、（245．7±11．6）个、（112．5±7.8）个，ARK5-shRNA-3转染组与正常对照组、阴性对照组差异有统计学意义（P〈0．01）。在葡萄糖饥饿和TNF-α处理24h后，正常对照组、阴性对照组和ARK5-shRNA-3转染组的细胞凋亡率分别为（11．7±3．2）％、（12．3±2．6）％和（30．8±4．3）％，ARK5-shRNA-3转染组与正常对照组、阴性对照组差异有统计学意义（P〈0．01）。结论成功构建了能高效沉默ARK5基因的重组慢病毒表达载体，并且明显地抑制了胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进了胃癌细胞在饥饿胁迫及TNF—α诱导情况下的凋亡。