家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。

家蚕驯化过程中受到选择的2个GMC氧化还原酶基因的序列变异分析

葡萄糖-甲醇-胆碱(glucose-methanol-choline,GMC)氧化还原酶家族在生物体内葡萄糖、胆碱和甾醇等物质的代谢过程中发挥重要作用。比较家蚕和野桑蚕的遗传变异图谱数据发现,GMC氧化还原酶基因家族成员GMC1(BGIBMGA000068)和GMC2(BGIBMGA000158)在家蚕驯化过程中受到显著的选择压力,其完整基因序列发生大量单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)突变,部分SNP突变位于外显子区并导致所编码蛋白质的氨基酸发生替换。基于全基因组芯片数据的表达谱分析显示,GMC1基因主要在家蚕5龄第3天幼虫的中肠和马氏管中表达,GMC2基因主要在丝腺和头部高量表达,暗示GMC1和GMC2在家蚕驯化过程中发生的序列变异可能与其在家蚕体内物质代谢及丝腺发育或丝蛋白合成等生物学过程中的功能有关。从家蚕丝腺组织中克隆获得家蚕GMC2基因的全长cDNA序列并进行原核表达,目的蛋白质以包涵体的形式存在。

偏肿革裥菌GMC基因家族在木质条件下转录表达分析

为揭示偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)在分解木材过程中葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(Glucosemethanol-choline oxidoreductases,GMCs)基因的功能,采用高通量测序技术对L.gibbosa分解木屑过程中0,3,5,7,11 d的菌丝体进行转录组测序,以Count值与校正后的FPKM值为表达量进行基因筛选。分析基因表达量变化情况及在eggNOG,COG,GO,KEGG,NR,SwissProt和Pfam等数据库中的功能注释结果,通过qPCR验证基因表达量。根据基因注释结果共筛选到23个GMCs基因,表达量变化表明其中有9个是差异基因。功能注释及富集结果表明,L.gibbosa的GMCs至少有6种,分别为纤维二糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖脱氢酶、L-山梨糖1-脱氢酶、醇氧化酶、吡喃糖氧化酶,属于CAZy-AA3家族下的4个亚家族,在木材木质素与综纤维素的降解过程中,它们主要参与能量转运和代谢有关的碳代谢、甲烷代谢、氨基酸代谢和脂质代谢;GMCs与木质素降解过程中H_(2)O_(2)的形成有特定关系,可与FAD结合,将初级醇基氧化形成醛并释放H_(2)O_(2),为过氧化物酶提供恒定反应底物。由于能在木质素和纤维素的降解过程中发挥重要的辅助作用,GMCs属于与木材降解相关的重要辅助酶系,为白腐菌中GMC家族在木材降解过程中的功能研究提供了依据。