马钱子碱诱导人葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡影响及作用机制研究

目的观察马钱子碱对人葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡的影响及作用机制。方法将体外培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞分为4组:对照组(CG)、马钱子碱低(BLG)、中(BMG)、高浓度组(BHG),CCK-8法测定细胞增殖率,苏木精-伊红(HE)染色法观察马钱子碱对黑色素瘤细胞形态的影响,Hoechst 33258核染色法观察细胞核凋亡,Annexin V/PI染色检测细胞凋亡率,Western blot法检测黑色素瘤细胞内Bax及Bcl-2蛋白表达。结果(1)细胞增殖率:与CG组比较,BLG组、BMG组及BHG组细胞增殖率均下降,差异有统计学意义(tBLG=7.964,P_(BLG)=0.000;t_(BMG)=12.920,PBMG=0.000;t_(BHG)=20.962,P_(BHG)=0.000);与BLG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=10.720,P=0.000);与BMG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=6.291,P=0.000)。(2)细胞凋亡率:与CG组比较,BLG组、BMG组及BHG组细胞凋亡率逐渐增加,差异有统计学意义(t_(BLG)=7.982,P_(BLG)=0.000;tBMG=12.744,P_(BMG)=0.000;t_(BHG)=15.960,P_(BHG)=0.000);与BLG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=6.940,P=0.000)。(3)Bax蛋白表达:与CG组比较,各组间差异有统计学意义(t_(BLG)=4.082,P_(BLG)=0.004;t_(BMG)=16.740,P_(BMG)=0.000;t_(BHG)=28.990,PBHG=0.000)。与BLG组比较,BMG组差异有统计学意义(t=12.660,P=0.000),BHG组差异有统计学意义(t=23.680,P=0.000)。与BMG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=11.020,P=0.000)。(4)Bcl-2蛋白表达:与CG组比较,各组间差异有统计学意义(t_(BLG)=6.678,P_(BLG)=0.000;tBMG=9.080,PBMG=0.000;t_(BHG)=10.079,P_(BHG)=0.000)。与BLG组比较,BMG组差异有统计学意义(t=10.340,P=0.000),BHG组差异有统计学意义(t=14.550,P=0.000)。与BMG组比较,BHG组差异有统计学意义(t=3.674,P=0.006)。结论马钱子碱通过改变线粒体凋亡途径中凋亡相关信号分子Bax及Bcl-2的表达,抑制黑色素瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。

SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的表观遗传调控

目的:探讨沉默信息调节蛋白1(SIRT1)对人葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响。方法:实验研究。通过定量PCR和Western blot法检测SIRT1在葡萄膜黑色素瘤细胞(M23和SP6.5)和正常人葡萄膜黑色素细胞(DM78、UM95和UM96)中的表达。在葡萄膜黑色素瘤细胞(M23、SP6.5)中,用EX527抑制SIRT1活性,以溶剂DMSO作为阴性对照组;用SIRT1小干扰RNA(siSIRT1)转染细胞抑制SIRT1表达,以无义小干扰RNA(NC)转染作为阴性对照组。细胞增殖实验(MTS)、流式细胞术、平板克隆形成实验分别检测细胞活性、细胞周期以及细胞克隆形成能力。裸鼠眼内成瘤实验检测葡萄膜黑色素瘤细胞眼内成瘤能力。Western blot法检测增殖相关蛋白。组间数据均采用独立样本t检验进行比较。结果:与葡萄膜黑色素细胞相比,葡萄膜黑色素瘤细胞(M23、SP6.5)中SIRT1 mRNA(t=17.08,P<0.001;t=13.24,P<0.001)和蛋白(t=6.26,P=0.008)表达水平显著升高。MTS结果显示,EX527抑制M23和SP6.5细胞活性,并呈药物浓度依赖性;与NC转染组相比,siSIRT1转染组细胞活性显著减弱(t=5.94,P<0.001;t=10.73,P<0.001)。与溶剂DMSO组相比,EX527处理组(t=5.10,P=0.047;t=7.57,P=0.002)和SIRT1 siRNA转染组(t=6.41,P=0.003;t=6.10,P=0.004)中处于G1期的细胞比例均显著升高。另外,M23和SP6.5细胞EX527处理组(t=5.04,P=0.001;t=5.93,P<0.001)和siSIRT1转染组(t=11.44,P<0.001;t=8.24,P<0.001)克隆形成数量显著降低。在裸鼠眼内成瘤实验中,与NC组相比,siSIRT1转染组眼内瘤体大小显著变小(t=5.50,P<0.001)。Western blot结果显示,与DMSO处理组相比,EX527处理组中P21(t=4.63,P=0.010;t=7.90,P=0.001)表达升高,E2F1(t=12.10,P=0.003;t=5.96,P=0.004)、CYCLIND2(t=36.28,P<0.001;t=16.58,P<0.001)、p-RB(t=17.55,P<0.001;t=21.34,P<0.001)表达降低,p-AKT表达下调。与NC转染组相比,siSIRT1转染组中,P21(t=5.88,P=0.004;t=10.51,P<0.001)表达升高,E2F1(t=4.60,P=0.01;t=4.89,P=0.008)、CYCLIND2(t=5.13,P=0.007;t=5.63,P=0.005)、p-RB(t=4.45,P=0.011;t=6.53,P=0.003)表达水平降低,p-AKT(t=9.61,P<0.001;t=6.44,P=0.003)表达下调。结论:抑制SIRT1活性或表达可以明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖,提示SIRT1可以作为治疗葡萄膜黑色素瘤的一个新靶标。