沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。

葡萄茎痘病毒病的RT-PCR检测

根据症状随机选取石河子大学校园内的多年生全球红、无核白等葡萄为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830bp的预期目的片段。将此目的片段纯化回收,克隆测序分析。与NCBI中的此病相关序列同源性达到96%。

美国进境大豆葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

对一批美国进境的非种用黄大豆和夹带的大豆茎秆进行了病原菌分离,在大豆茎秆上分离到1株疑似葡萄茎枯病菌的菌株Pg-84302。通过对该菌株进行病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测,结果表明菌株Pg-84302在PDA培养基和大豆茎秆上均产生大量分生孢子器、分生孢子和砖格状厚垣孢子,分生孢子器通常为球形;经真菌通用引物扩增和测序,其与GenBank中Phoma glomerata序列(登录号:EU098115.1、AF126819.1、EU273521.1、AY183371.1)的同源性为100%;该菌不仅能侵染大豆,还侵染小麦和苹果。根据上述实验结果,将分离获得的菌株Pg-84302鉴定为葡萄茎枯病菌(Phoma glomerata(Corda)Wollenweber et Hochapfel)。

进境高粱种子中葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

从进境的美国高粱样品中分离到一株与葡萄茎枯病菌Didymella glomerata相似的菌株4358-17。其菌落形态和显微特征均与葡萄茎枯病菌一致。多个位点(LSU、ITS、TUB2、ACT)序列比对显示菌株4358-17与GenBank登录号为KT389718、FJ427004、FJ427115、FJ426896的葡萄茎枯病菌相似性均达到100%。系统发育分析结果表明菌株4358-17与葡萄茎枯病菌株聚集在同一个分支上,支持率为99%。菌株4358-17接种高粱和小麦叶片,4d后接种部位出现明显症状。根据上述试验结果,将进境美国高粱样品中分离的菌株4358-17鉴定为葡萄茎枯病菌。

葡萄茎痘伴随病毒cDNA探针检测技术研究

选取经RT-PCR检测确认带葡萄茎痘伴随病毒的全球红葡萄品种,以葡萄叶片、皮层作为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830 bp的预期目的片段,并将其克隆测序,其同源性与NCBI中的相关序列的同源性达96%。利用克隆质粒合成了生物素标记的GRSPaV的cDNA探针,在此基础上,研究了影响GRSPaV斑点杂交的因素,结果表明当探针浓度为200 ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应4 h,可获得较高灵敏度。

山东省沙地葡萄茎痘相关病毒的检测

为明确沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)在山东省发生的情况,2006-2007年在葡萄主栽区和葡萄品种资源圃进行了田间调查、样品采集和病原检测。应用GRSPaV外壳蛋白基因表达获得的多克隆抗体,经间接酶联免疫吸附试验(PTA-ELISA)和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测,在2a采集的298个样品中,125个样品为阳性反应,阳性率41.95%。125个阳性样品涉及43个品种,品种被侵染率74.14%。研究对检测的样品用RT-PCR法验证,有3对引物均扩增出了预期片段,分别为解旋酶基因340bp片段、外壳蛋白(CP)基因842bp片段和RNA聚合酶(RdRp)基因499bp片段。

利用内标为基础的RT-PCR技术检测葡萄茎痘伴随病毒

选取经RT-PCR检测确认带葡萄茎痘伴随病毒的‘全球红’葡萄品种。以葡萄叶片、韧皮部作为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830bp的预期目的片段。以线粒体nad5基因为内标,建立了GRSPaV与nad5共扩增体系,将扩增的GRSPaV特异性片段及nad5目的片段分别克隆测序,与NCBI中所提交的核酸序列进行比对,GRSPaV与序列号AF057136的同源性达96%;nad5与序列号D37958的同源性达96·67%。

葡萄茎枯病菌生物学特性及室内药剂筛选研究

葡萄茎枯病菌是一种适生性十分广泛的检疫性真菌,国内尚未有发生为害报道。2012年宁波检验检疫局全国首次从进境意大利苹果种苗中截获了该病菌,为探索有效检疫处理和病菌防治手段,对该菌生物学特性和防治药剂室内筛选开展了研究。结果表明,葡萄茎枯病菌在供试PDA、OA、MEA、V8、H、CMA培养基上10~30℃条件下均可生长,35℃生长受到完全抑制,以在PDA培养基上25℃条件下生长速度最快。供试菌株对pH值适应范围较广,pH值4~11条件下均可生长,以pH值为8时生长最快。室内药剂筛选试验表明50%速克灵可湿性粉剂等7种药剂处理对病原菌菌落生长抑制率达100%,22.7%二氰蒽醌悬浮剂等12种药剂处理,对病原菌分生孢子萌发抑制率为100%。

沙地葡萄茎痘伴随病毒双重巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的沙地葡萄茎痘伴随病毒(grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)全基因组序列设计了2组巢式RT-PCR检测引物repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2,扩增片段分别为902 bp和438 bp。通过对第1轮PCR扩增中引物组合repF1/R1-cpF1/R1、dNTPs、Taq DNA聚合酶和cDNA用量的优化,以及第2轮PCR扩增中引物组合repF2/R2-cpF2/R2、dNTPs和Taq DNA聚合酶用量的优化,建立了GRSPaV双重巢式RT-PCR检测方法。采用该方法对109份葡萄样品进行检测,结果显示,2对普通PCR引物RSP 52/53和RSP 9F/9R的合计检出率为65.1%,2组单一巢式PCR引物repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2的检出率总和为93.6%,而双重巢式PCR引物组合repF1/R1-cpF1/R1→repF2/R2-cpF2/R2的检出率也达到93.6%。该技术在保证检测效率的基础上降低了检测成本,适用于大量田间样品的检测。

沙地葡萄茎痘相关病毒在‘阳光玫瑰’葡萄树不同物候期和不同部位的变化规律

【背景】沙地葡萄茎痘相关病毒(grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV)是皱木复合病中最常见的一种病毒,主要通过无性繁殖传播,灵敏的检测技术和培育无病毒植株是预防GRSPaV危害的关键。【目的】建立GRSPaV检测体系,确定适宜样品采集时期及部位,为病毒检测和无病毒材料培育及样品采集提供参考。【方法】建立基于AugeGreen染料法和外壳蛋白(coat protein,CP)基因区域设计引物的RT-qPCR检测方法,对携带GRSPaV的‘阳光玫瑰’葡萄树地上部不同物候期、不同部位的样品进行GRSPaV检出率及基因表达量分析。【结果】以GRS q CP1为引物的GRSPaV RT-qPCR检测方法灵敏度较RT-PCR高10倍。GRSPaV在萌芽期、新梢生长期和花期的检出率均为100%,果实膨大期为91.7%;成熟卷须为94.4%,成龄叶片、成龄叶柄和幼嫩枝条均为100%。检测为阴性的样品均为幼嫩部位。GRSPaV CP基因表达量在花期幼嫩卷须中最高,其次为花期成龄叶片;成龄叶中表达量在果实膨大期至成熟期均为同物候期内表达量最高部位;当年冬芽的萌芽期及二次枝的新梢生长期表达量均较低。【结论】‘阳光玫瑰’葡萄GRSPaV检出率和GRSPaV CP基因表达量随物候期进程表现差异,检出率在萌芽期至花期最高,果实成熟期最低;GRSPaV CP基因表达量在花期最高。综合检出率及表达量因素,花期成龄叶适合作为GRSPaV病毒检测样品;果实膨大期至成熟期当年冬芽及萌发的二次枝适合作为脱除病毒材料。

葡萄茎秆切割装置作业参数优化与试验

为探究露地酿酒葡萄茎秆对机械化切割力的影响关系,通过力学特性试验测定修剪期葡萄茎秆弹性模量与抗压强度,确定葡萄茎秆断裂时的抗剪强度在5.0~9.0 MPa。对切割器—葡萄茎秆建立几何模型进行动力学仿真,借助有限元分析软件ANSYS/LS-DYNA分析往复式切割器切割过程,得到葡萄茎秆修剪过程中位移云图、等效应力云图、能量曲线和切割力曲线。在此基础上进行三因素三水平仿真试验,得到切割装置工作参数对切割力的影响从大到小排序为切割倾角、液压马达转速、行进速度,运用Design-Expert12.0软件优化分析得到切割装置最优参数组合:切割倾角为9°、液压马达转速为700 r/min、行进速度为1.5 m/s。运用最优参数组合进行田间试验,结果表明:往复式葡萄茎秆修剪机的漏剪率为5.4%,撕裂率为4.6%,葡萄茎秆切割装置最优作业参数可满足葡萄园茎秆修剪作业要求。

广西不同地区显齿蛇葡萄茎中黄酮类成分含量测定

目的:建立显齿蛇葡萄茎中黄酮成分的含量测定方法,并分析广西不同地区显齿蛇葡萄茎中二氢杨梅素及杨梅素的含量。方法:采用高效液相色谱法,安捷伦Poroshell EC-C18(4.6mm×250.0mm,4.0μm)为色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸为流动相,梯度洗脱,流速1mL·min-1,柱温25℃,检测波长0~23min,330nm;23~50min,375nm。结果:显齿蛇葡萄茎中二氢杨梅素和杨梅素进样量分别在0.800 5~9.606 0μg(r=0.999 87)和0.100~1.202μg(r=0.999 72)范围内呈良好的线性关系;平均加样回收率分别为98.1%、99.9%,RSD<3%,方法的稳定性、重复性和精密度均良好(RSD<3%)。桂林灵川和岑溪大隆的显齿蛇葡萄茎中二氢杨梅素和杨梅素的含量均较高,武鸣双江和金秀互助村的显齿蛇葡萄茎中二氢杨梅素和杨梅素含量均较低。结论:不同地区显齿蛇葡萄茎中二氢杨梅素和杨梅素的含量相差较大。所建立的方法可较好地去除杂质,分离效果好,测定结果准确性、重复性好。

葡萄茎痘病毒研究进展

本文综述了近年来国内外葡萄茎痘病毒研究进展,介绍了葡萄茎痘病分布、危害及生物学特征;综述了近几年来基因组结构及分子多样性研究进展;概述了免疫学、分子生物学等病毒检测技术在葡萄茎痘病毒中的应用和最新进展。同时针对我国葡萄病毒病的研究提出了几点问题和展望。

基于DNA序列分析的葡萄茎枯病菌检疫鉴定

葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物,目前口岸对葡萄茎枯病菌的检疫鉴定主要依靠形态学观察,然而单纯利用形态学难以对其进行准确鉴定,需与分子生物学方法相结合。为找出有效分子标记,本研究以宁波口岸截获鉴定的41株葡萄茎枯病菌分离株和收集自ATCC和CBS的2株葡萄茎枯病菌为研究对象,对上述菌株进行形态学观察,ITS、actin和β-tubulin基因序列测定,同时采用序列分析手段考察上述基因片段在葡萄茎枯病菌鉴定区分上的应用价值。研究结果表明葡萄茎枯病菌形态变异较大,ITS无法有效区分葡萄茎枯病菌,actin和β-tubulin基因片段能够将葡萄茎枯病菌从近似种中准确划分出来,利用3个基因片段联合建树区分能力较强。

进境澳大利亚大麦上葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

自进境澳大利亚大麦样品上,采用常规平板分离法获得1株疑似葡萄茎枯病菌菌株74919。通过形态学特征观察、β-tubulin和actin序列比对分析以及致病性测定,对该菌株进行了种类鉴定。结果表明:菌株74919在PDA培养基上生长良好,可产生大量分生孢子器和厚垣孢子;基于β-tubulin和actin序列构建的系统发育树中,菌株74919和其他葡萄茎枯病菌相关序列划分在同一分支;菌株74919接种大麦叶片,在接种部位引起叶斑症状。根据上述实验结果,将菌株74919鉴定为葡萄茎枯病菌(Didymella glomerata),这是我国口岸首次从进境澳大利亚大麦中截获葡萄茎枯病菌。

葡萄茎尖培养与无病毒化

一、培育无病毒母本树的背景日本从1960年前后,因山梨县甲州种葡萄由病毒引起的无味果病,才开始对葡萄病毒的重视。无味果病除果实外,病树外观无任何症状。病树果实成份特别是含糖量比健树减少5～6度。关于无味果的病原,根据难波等(1979)报告,乃系病毒所致并确定为无味果病毒(GAV)。

草莓葡萄茎分株繁殖技术

1 母本园繁殖技术 1.1 整地施肥母本园应建在地面平坦,土质疏松,有机质丰富,排灌方便,光照良好的地块上.草莓喜肥,每亩施3 000千克有机肥,均匀撒施;结合施用氮、磷、钾复合肥,每亩施25千克.整地时将有机肥和复合肥深翻入土,然后打埂作畦.畦宽1～2米,畦长20米或与地块等长,畦埂要直,畦面要平整,以便于灌水.栽植前土壤要适当浇水沉实,防栽植后浇水时幼苗在土壤中深浅不一或露根,提高成活率.

响应面法优化长茎葡萄蕨藻多糖提取工艺及抗氧化活性

为了探究提取长茎葡萄蕨藻多糖的最优工艺及抗氧化活性,对目前已有的多糖提取方法进行筛选,并采用单因素实验和响应面实验的方法,对料液比、提取温度、提取时间、木瓜蛋白酶添加量和提取次数这5个因素进行优化。结果显示,添加木瓜蛋白酶提取长茎葡萄蕨藻多糖的方法最高效便捷,且当料液比1∶40,提取温度50℃,提取时间3 h,提取次数2次,以及木瓜蛋白酶添加量为2.0%时,长茎葡萄蕨藻多糖提取率相对较高,可达到41.24%±0.09%。进一步的实验结果显示,长茎葡萄蕨藻多糖对DPPH和ABTS自由基均具有良好的清除活性,其IC50值分别为2.32和0.67 mg/mL。研究表明,使用优化后的木瓜蛋白酶酶解法能有效提高长茎葡萄蕨藻多糖的提取率,且长茎葡萄蕨藻多糖具有良好的抗氧化活性。本研究可为长茎葡萄蕨藻多糖的开发利用提供理论基础和参考依据。

超声辅助复合酶法提取长茎葡萄蕨藻藻渣多糖及其降脂功能

该研究探讨了优化超声波辅助复合酶法从长茎葡萄蕨藻藻渣中提取多糖的工艺条件,并探究其降脂功能。以长茎葡萄蕨藻藻渣为原料,在单因素试验的基础上,利用响应面法优化提取多糖的最佳参数;通过与胆酸盐的结合能力在体外评价长茎葡萄蕨藻藻渣多糖降脂作用;采用高脂饮食诱导小鼠建立高脂血症模型,以长茎葡萄蕨藻藻渣多糖灌胃干预,4周后评价其体内降脂效果。长茎葡萄蕨藻藻渣多糖的最佳提取条件为复合酶(中性蛋白酶:木聚糖酶:纤维素酶=1:1:1)质量分数2.5%,酶解温度48℃,酶解时间123 min,多糖得率可达36.62%,质量分数为87.20%。长茎葡萄蕨藻藻渣多糖(10 mg/mL)与胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠结合率分别为86.56%、89.47%、84.26%和64.68%。与模型组比较,长茎葡萄蕨藻藻渣多糖(200、400 mg/kg)显著减轻小鼠体质量(11.29%、15.38%),降低脂肪系数(4.07%、3.18%)及血清中TG(59.87%、68.42%)、TC(28.24%、39.08%)和LDL-C(34.93%、49.28%)水平,提高HDL-C(52.67%、99.00%)水平。优化得到的超声波辅助复合酶法提取长茎葡萄蕨藻藻渣多糖的条件合理可靠,所得多糖有较强的结合胆酸盐能力,对高脂饮食诱导的高血脂症具有预防作用。

我国部分地区沙地葡萄茎痘相关病毒分离物外壳蛋白序列变异分析

为明确我国葡萄中沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)的感染情况及病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因的变异特点,从而为其致病性、病害的防治以及抗病毒基因工程等研究提供依据,本研究对采自我国16个省市自治区的65个葡萄品种305株葡萄样品中的GRSPaV进行RT-PCR检测,根据地区与品种差异选取了24个阳性样品进行cp基因克隆与测序分析,并对不同RNA提取方法进行了比较。结果显示,114株样品被GRSPaV侵染,平均带毒株率为37.4%;分离物间及同一分离物不同克隆间的序列差异较大,从24个分离物克隆获得的37条cp基因序列与来源于不同国家的12个GRSPaV分离物的核苷酸序列同源性为80.5%~99.7%,氨基酸序列同源性为88.8%~100%;各个分离物的遗传距离无明显地域差异;SiO2吸附法比SDS法和CTAB法更适宜葡萄样品RNA的提取。