进境高粱种子中葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

从进境的美国高粱样品中分离到一株与葡萄茎枯病菌Didymella glomerata相似的菌株4358-17。其菌落形态和显微特征均与葡萄茎枯病菌一致。多个位点(LSU、ITS、TUB2、ACT)序列比对显示菌株4358-17与GenBank登录号为KT389718、FJ427004、FJ427115、FJ426896的葡萄茎枯病菌相似性均达到100%。系统发育分析结果表明菌株4358-17与葡萄茎枯病菌株聚集在同一个分支上,支持率为99%。菌株4358-17接种高粱和小麦叶片,4d后接种部位出现明显症状。根据上述试验结果,将进境美国高粱样品中分离的菌株4358-17鉴定为葡萄茎枯病菌。

美国进境大豆葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

对一批美国进境的非种用黄大豆和夹带的大豆茎秆进行了病原菌分离,在大豆茎秆上分离到1株疑似葡萄茎枯病菌的菌株Pg-84302。通过对该菌株进行病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测,结果表明菌株Pg-84302在PDA培养基和大豆茎秆上均产生大量分生孢子器、分生孢子和砖格状厚垣孢子,分生孢子器通常为球形;经真菌通用引物扩增和测序,其与GenBank中Phoma glomerata序列(登录号:EU098115.1、AF126819.1、EU273521.1、AY183371.1)的同源性为100%;该菌不仅能侵染大豆,还侵染小麦和苹果。根据上述实验结果,将分离获得的菌株Pg-84302鉴定为葡萄茎枯病菌(Phoma glomerata(Corda)Wollenweber et Hochapfel)。

葡萄茎枯病菌生物学特性及室内药剂筛选研究

葡萄茎枯病菌是一种适生性十分广泛的检疫性真菌,国内尚未有发生为害报道。2012年宁波检验检疫局全国首次从进境意大利苹果种苗中截获了该病菌,为探索有效检疫处理和病菌防治手段,对该菌生物学特性和防治药剂室内筛选开展了研究。结果表明,葡萄茎枯病菌在供试PDA、OA、MEA、V8、H、CMA培养基上10~30℃条件下均可生长,35℃生长受到完全抑制,以在PDA培养基上25℃条件下生长速度最快。供试菌株对pH值适应范围较广,pH值4~11条件下均可生长,以pH值为8时生长最快。室内药剂筛选试验表明50%速克灵可湿性粉剂等7种药剂处理对病原菌菌落生长抑制率达100%,22.7%二氰蒽醌悬浮剂等12种药剂处理,对病原菌分生孢子萌发抑制率为100%。

进境意大利苹果苗上葡萄茎枯病菌的截获鉴定

葡萄茎枯病菌{Phoma glomerata（Corda）Wol—lenweber＆Hochapfel]已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，是一种检疫性植物病原真菌。目前，该病菌分布于意大利、希腊、瑞典、印度、澳大利亚、以色列、秘鲁、匈牙利美国等国家。该病菌寄主范围广，可为害近百种植物，造成葡萄枯萎病、松树猝倒病、小麦叶斑病、苹果叶部和果实病害、番茄、马铃薯和柑桔腐烂等[1，2]，

基于TaqMan MGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光PCR检测方法

葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6μmol·L-1,探针终浓度为0.6μmol·L-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。

基于DNA序列分析的葡萄茎枯病菌检疫鉴定

葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物,目前口岸对葡萄茎枯病菌的检疫鉴定主要依靠形态学观察,然而单纯利用形态学难以对其进行准确鉴定,需与分子生物学方法相结合。为找出有效分子标记,本研究以宁波口岸截获鉴定的41株葡萄茎枯病菌分离株和收集自ATCC和CBS的2株葡萄茎枯病菌为研究对象,对上述菌株进行形态学观察,ITS、actin和β-tubulin基因序列测定,同时采用序列分析手段考察上述基因片段在葡萄茎枯病菌鉴定区分上的应用价值。研究结果表明葡萄茎枯病菌形态变异较大,ITS无法有效区分葡萄茎枯病菌,actin和β-tubulin基因片段能够将葡萄茎枯病菌从近似种中准确划分出来,利用3个基因片段联合建树区分能力较强。

进境澳大利亚大麦上葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

自进境澳大利亚大麦样品上,采用常规平板分离法获得1株疑似葡萄茎枯病菌菌株74919。通过形态学特征观察、β-tubulin和actin序列比对分析以及致病性测定,对该菌株进行了种类鉴定。结果表明:菌株74919在PDA培养基上生长良好,可产生大量分生孢子器和厚垣孢子;基于β-tubulin和actin序列构建的系统发育树中,菌株74919和其他葡萄茎枯病菌相关序列划分在同一分支;菌株74919接种大麦叶片,在接种部位引起叶斑症状。根据上述实验结果,将菌株74919鉴定为葡萄茎枯病菌(Didymella glomerata),这是我国口岸首次从进境澳大利亚大麦中截获葡萄茎枯病菌。