酵母pac1基因介导对葡萄B病毒的抗性

为明确广谱性抗病毒基因—酵母pac1基因对葡萄B病毒（Grapevine virus B,GVB）的抗性效果,通过农杆菌介导的遗传转化,将pac1基因导入西方烟37B,对转基因植株进行PCR鉴定及Southern blot分析,通过病毒摩擦接种观察症状以及实时荧光定量RT-PCR检测植株体内病毒含量,并对转基因植株抗病性进行初步鉴定。结果表明,目的基因pac1成功导入并整合至西方烟37B基因组,共获得10个转基因株系。不同株系的T1代烟草中阳性植株比例为16.7%~72.7%,表明目的基因可成功遗传到子代。接种病毒后转基因植株普遍延迟发病,但后期症状与非转基因对照相似,其中仅1个转基因株系B6具有不表现典型症状等抗性反应。接种植株病毒含量检测中,所有转基因植株均检测到病毒存在,但表现为抗病的B6株系中病毒含量显著低于非转基因对照,表明该转基因植株虽不能完全抵抗GVB侵染,但对GVB具有耐病性。

葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究

旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。

葡萄病毒B CP基因植物表达载体构建及烟草遗传转化

葡萄病毒B Grapevine virus B(GVB)是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原,为开展抗GVB转基因研究,本研究利用RT-PCR技术克隆GVB外壳蛋白(coat protein,CP)基因,与植物表达载体pRI 101-AN连接构建植物表达载体pRI-GVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRI-GVB CP导入农杆菌LBA4404,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B’。共获得16个烟草再生株系,PCR检测其中3个株系为阳性,阳性株系播种获得的64株T_1代植株中有30株扩增到目的条带,阳性率为46.9%,表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T_1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定,其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。

葡萄病毒B优化检测体系的建立

为了解决种苗检疫、抗病性早期鉴定等基本问题,为葡萄无毒化栽培的提供基本保障。本实验从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板进行一步RT-PCR扩增,并利用此扩增产物为模板进行二次扩增,二者均能获得与预期片段大小一致长约460bp和243bp的扩增产物,在此基础上,建立了萄病毒B的一步RT-PCR、巢式PCR以及斑点杂交优化检测体系。利用本实验所建立的优化检测体系对葡萄样本进行检测,表现出了良好的特异性与稳定性。

葡萄病毒B内蒙古分离物全基因组序列分析

【目的】获得葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)内蒙古分离物全基因组序列,并且分析该病毒基因组结构及与已报道的GVB分离物的序列一致性和系统进化关系。【方法】以阳光玫瑰葡萄叶片为样品,提取RNA,根据NCBI中Genbank数据库中已报道的22条GVB全基因组序列的保守区分别设计3对GVB基因片段扩增所用引物,采用RTPCR结合RACE技术,克隆GVB全基因组序列,并进行序列分析和同源性比对以及系统进化关系的分析。【结果】成功获得了2个GVB内蒙古分离物全长基因组(GVB Hohhot-1、GVB Hohhot-2),大小均为7609 nt,均编码5个开放阅读框(open reading frame,ORF)。GVB Hohhot-1、GVB Hohhot-2分离物与22个已报道的GVB分离物全基因核苷酸一致性分别为74.9%~96.5%和74.8%~96.4%。系统发育分析结果表明,24个GVB分离物基于全基因组序列构建的进化树分为2个大组,基于外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列构建的进化树分为4组。本研究中2个GVB内蒙古分离物与加拿大分离物(登录号:MZ440726)的亲缘关系最近,一致性分别为96.5%、96.4%。在24个GVB全长基因组序列间无重组事件。【结论】首次获得GVB内蒙古分离物的全基因组序列,分析了基因组的基本特征,并且阐明了该病毒与已报道的GVB分离物的序列一致性和系统进化关系,为我国GVB分类地位、病毒进化规律研究,以及后续开展侵染性克隆奠定了一定基础。

三种葡萄病毒的RT-PCR检测和系统进化分析

【目的】为了研究不同葡萄病毒病快速检测方法和四川分离株系统进化,【方法】比较3种葡萄总RNA提取方法,还优化了葡萄病毒病的RT-PCR检测方法。分别克隆了3种病毒四川分离株的部分基因组区域,并开展了系统进化分析。【结果】结果表明,改进硅胶颗粒吸附法快速从葡萄枝条的韧皮组织中提取了总RNA,并以葡萄18SRNA为内参基因,RT-PCR分别成功扩增出3种病毒的目的片段。把16个地理起源的GLRaV-2分离株的外壳蛋白基因(Coat protein,CP)分成5个系统进化组。而7个地理起源的GVB分离株CP同源性为79.1%～98.7%。此外,5个GVA四川分离株分别位于系统进化树的4个聚类群。【结论】GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分离株在核酸水平上具有变异性,其中GVA四川分离株之间具有显著的遗传差异,可能包括4种株系。

应用实时荧光定量RT-PCR高效检测葡萄病毒B

本研究建立了葡萄病毒B的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线扩增效率102.4%,相关系数0.999,最低检测限达10-4倍稀释cDNA,灵敏度为常规RT-PCR的100倍。重复性试验组内和组间变异系数分别为0.00%~0.65%和0.02%~2.00%,表明检测稳定性好。该技术对田间葡萄样品检测适用范围广,对枝条和老叶柄检测效果最好,冬季枝条和春夏秋季所有老叶柄样品检出率均为100%,与常规RT-PCR检测结果一致。对于其他季节或部位样品,RT-qPCR检出率(43%~74%)则普遍高于常规RT-PCR(5%~71%),特别是春季样品和春夏秋季所有嫩叶样品,检出率比常规RT-PCR分别高31%和38%。对来自我国13个省21个品种的52份田间葡萄样品检测结果表明,RT-qPCR共检测到6个样品为阳性,检出率11.5%,为常规RT-PCR(检出率5.8%)的2倍。

葡萄病毒B外壳蛋白原核表达及抗血清制备

根据已报道的葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法从葡萄中扩增获得GVB外壳蛋白基因(cp),大小为594 bp。通过序列测定和分析,选取优势分离物GVB-JFL cp基因克隆到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化融合蛋白pET-GVB CP。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白获得过量表达,分子量约26 kD。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗血清。采用间接ELISA和dot-ELISA对抗血清特异性进行检测,结果表明,抗血清可与感染GVB的西方烟和葡萄样品发生阳性反应,与健康植株及感染同属另一种病毒葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)的样品不反应,阳性样品检测效价达1︰4 000,16个田间样品摩擦接种至烟草后有9个样品ELISA检测为阳性,表明制备的抗血清可用于GVB的特异性检测。

葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

以复合感染4种病毒的‘红地球’(Red Globe)葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3)、沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV)、葡萄病毒B(Grapevine virusB,GVB)和葡萄病毒A(Grapevine virusA,GVA)的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。