蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10于大肠杆菌不同载体的可溶性表达策略研究

蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10,AmPR-10)具有核酸酶活性,对黄芪生长发育及抗病机制具有重要意义。但从天然黄芪中提取蛋白质的传统方法成本较高,蛋白得率较少。研究首次利用大肠杆菌表达体系对AmPR-10进行可溶性外源表达,构建了3种重组子:①以p ET28a为载体构建p ET28a-AmPR-10;②以p ET30a为载体构建p ET30a-AmPR-10;③以p ET30a为载体、大肠杆菌分子伴侣skp修饰构建p ET30a-skp-AmPR-10。通过SDS-PAGE分析,目的蛋白可溶性表达量比较结果是:p ET30a-skp-AmPR-10>p ET30a-AmPR-10>p ET28a-AmPR-10。由蛋白质三级结构模拟分析发现,载体p ET-30a上的标签S-tag通过影响AmPR-10局部α螺旋构象而提高目标蛋白的可溶性表达,分子伴侣skp通过提高融合蛋白整体α螺旋比例进一步提升目标蛋白可溶性表达量。研究解决了目前从天然黄芪中提取蛋白操作复杂、提取量小的问题。同时,经测定,目的蛋白具有核酸酶活性,为外源AmPR-10相关活性研究提供了依据。

蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10纯化及生物学功能研究

蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein 10,AmPR-10)在蒙古黄芪遭遇环境压力和病原体侵袭时大量表达,该研究旨在探讨AmPR-10的生物学功能。蒙古黄芪干燥根经机械粉碎后缓冲液浸提得到蒙古黄芪总蛋白粗提液,总蛋白粗提液经阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化后得到电泳纯AmPR-10。以不同RNA为底物,通过检测260 nm吸光度分析核酸酶活性,结果显示AmPR-10对Yeast tRNA,Yeast RNA,Poly(A)和Poly(C)均表现核酸酶活性,且其最佳反应温度为50℃,最佳反应pH为78,EDTA对其活性无影响,Mg^2+对其活性具有激活作用,Co^2+,Ca^2+和Zn^2+对其活性具有抑制作。AmPR-10与已知核酸酶无序列同源性,可能是一种新的核酸酶。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法分析AmPR-10木瓜蛋白酶抑制活性,结果显示AmPR-10是木瓜蛋白酶的非竞争性抑制剂。AmPR-10可能通过抑制半胱氨酸酶活性在蒙古黄芪对抗环境压力和抵御病原体侵袭的过程中发挥重要作用。

黄芪中一种新的PR-10蛋白的纯化和性质

为了进一步研究蒙古黄芪(Astragalus mongholicusBunge)中的蛋白质及其功能,通过金属离子螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤得到一种新蛋白(AmPR-10),并对其部分性质进行了研究。AmPR-10在SDS-PAGE上的分子质量为17.2 ku,凝胶过滤层析测得分子质量为32.6 ku,说明其为同源二聚体。糖蛋白染色显示为糖蛋白,总糖含量为13.7%,离子交换色谱法分析其中含有73%阿拉伯糖、15%葡萄糖、微量的果糖和一种未知糖;N-端序列分析结果显示其与病程相关蛋白家族PR-10中黄羽扇豆L1PR-10.1C同源性高达80%。同时,AmPR-10具有核糖核酸酶活性,纯AmPR-10的核糖核酸酶比活性为74.11 U/mg,这点与一些PR-10蛋白类似。

同源蛋白序列比对探讨AmPR-10核酸酶活性机理

蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)对黄芪生长发育及抗病机制有重要意义。研究检测出以大肠杆菌为宿主外源表达的AmPR-10具有核酸酶活性。将AmPR-10与其同源的7个已证明具有核酸酶活性的蛋白进行氨基酸序列比对,发现AmPR-10基因有4个高保守区段,分别是:14~24位、44~55位、64~70位及83~88位。其中第一段保守区与C-末端的α螺旋在空间上形成较强的疏水区以稳定蛋白空腔的结构,利于AmPR-10在抵御侵害时功能的发挥;另由分子对接和氨基酸单点突变发现第4段保守区的83位Tyr是AmPR-10具有核酸酶活性的关键位点,其突变会影响目标蛋白与底物结合的稳定性,而非保守区域140位Gly可作为基因进化的参考位点,当突变为Asn、Val及Trp时,AmPR-10与底物的结合自由能下降。以上结果对深入理解及优化AmPR-10的核酸酶活性具有理论指导意义。

蒙古黄芪不同组织中AmPR-10的诱导表达研究

为探究病程相关蛋白AmPR-10(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)在蒙古黄芪生长发育中的功能,研究对试验植株分别进行盐溶液灌溉、腐皮镰孢菌侵染及水杨酸喷洒处理后,通过荧光定量PCR检测根、茎、叶中AmPR-10的表达特征。结果表明:①盐胁迫和病原菌胁迫时,根中AmPR-10的表达量与茎、叶相比为极显著(P<0.01),说明AmPR-10主要参与了根的抗胁迫过程,在响应蒙古黄芪抗病防御时发挥作用,并且在0.085 mol/L盐浓度胁迫下,根中AmPR-10的表达量在6 h出现极显著(P<0.01),腐皮镰孢菌胁迫时,第48 h也可达到极显著(P<0.01),说明AmPR-10是蒙古黄芪在遭遇逆环境时启动抵御系统且快速表达的一种蛋白;②与前2种诱导条件相比,水杨酸诱导后,茎和叶中的AmPR-10表达量明显提高,并且在5.0 mmol/L浓度下,叶片中AmPR-10表达量可在6 h达到极显著(P<0.01),茎中AmPR-10表达量也有多个极显著点(P<0.01),这说明水杨酸作为植物抗病信号分子可促进AmPR-10的表达。该研究表明,AmPR-10在蒙古黄芪生长过程中具有重要意义,为抗病黄芪幼苗的培育提供理论依据。