蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达

目的:通过在原核表达系统中表达蓖麻的可溶性脂肪酸去饱和酶基因和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶基因,为脂肪酸去饱和酶序列结构与功能的研究奠定基础。方法:将蓖麻RCD△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶基因亚克隆到大肠杆菌BL21表达载体pET32a+中,获得重组表达载体pET32a+-R9,pET32a+- F1,并通过SDS-PAGE和Western Blotting鉴定蛋白的表达情况。结果:经PCR和测序鉴定,证实两个重组质粒含有目的基因片段;SDS-PAGE和Western Blotting证实两种蛋白在大肠杆菌中获得表达,但表达量具有明显的不同;Anthepro软件对蛋白跨膜结构的分析,验证蓖麻△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶在结构上的不同。结论:蓖麻的RCD脂肪酸去饱和酶和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶都得到了表达,但线虫fat-1脂肪酸去饱和酶表达量偏低;这可能与fat-1脂肪酸去饱和酶是一类跨膜蛋白的性质直接相关。因此,对于线虫fat-1脂肪酸去饱和酶的基于蛋白纯化的结构分析有待进一步的研究。

中华绒螯蟹Δ9脂肪酸去饱和酶基因克隆与原核表达

根据中华绒螯蟹FAD9基因cDNA序列(Accession Number:JQ693685)设计引物,扩增得到中华绒螯蟹FAD9基因的开放阅读框(ORF),用原核表达载体p Cold-TF DNA成功构建重组表达载体p Cold-fad9,将p Cold-fad9转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S,在异丙-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下进行表达。SDS-PAGE分析表明,诱导后出现的特异性蛋白条带,大小与预期理论值(95.10 k D)相符。当IPTG浓度为0.3 mmol/L时,在15℃条件下诱导20 h,重组蛋白的表达量最高。目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。利用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行了纯化,用Western-blotting方法验证了该重组蛋白可以与anti-His抗体特异性结合。研究结果为中华绒螯蟹FAD9重组蛋白的大量纯化及活性检测奠定基础,也为今后进一步开展脂肪酸去饱和酶功能的研究提供参考。

亚油酸水合酶生物合成微生物源羟基不饱和脂肪酸的研究进展

羟基不饱和脂肪酸(Hydroxy unsaturated fatty acids,HUFA)是一类功能性脂肪酸,其生物合成法特异性强、对环境友好,是HUFA制备的主要方法之一。本文就两种较受关注的微生物源HUFA,即10-羟基-12-十八碳烯酸(10-hydroxy-12-octadecenoic acid,10-HOE)、13-羟基-9-十八碳烯酸(13-hydroxy-9-octadecenoic acid,13-HOE)进行了来源、功能特性及应用的介绍,归纳总结了用于合成10-HOE和13-HOE的亚油酸水合酶的研究进展;最后展望了HUFA功能特性和生物合成的研究方向,建议基于胶体界面化学理论来提高亚油酸水合酶合成HUFA的转化效率。

中华绒螯蟹Δ9-脂肪酸去饱和酶基因克隆和真核表达系统的构建

Δ9-脂肪酸去饱和酶是多不饱和脂肪酸合成途径的关键酶之一,可催化脂肪酸链上特定位置形成双键。本研究在已克隆到中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Δ9-脂肪酸去饱和酶(Δ9 fatty acyl-Co A desaturase,Δ9-FAD)基因基础上,为进一步了解其功能,根据中华绒螯蟹Δ9-FAD基因c DNA序列(accession number:JQ693685)以及真核表达载体p PIC3.5K,设计引物并在其上下游分别加入Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位点;利用反转录PCR(RT-PCR)技术,克隆其开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,构建重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD;利用电穿孔仪将经限制性内切酶SacⅠ线性化后的重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中。经筛选与PCR验证,得到含有重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD的毕赤酵母转化株。本实验成功构建了中华绒螯蟹Δ9-脂肪酸去饱和酶的毕赤酵母表达系统,为深入研究Δ9-脂肪酸去饱和酶的功能做了基础性的工作。

DGLA及ETA合成的多基因植物表达载体的构建

Δ8去饱和酶和Δ9链延长酶是二高-γ-亚麻酸(DGLA)和二十碳四烯酸(ETA)合成的关键酶。本研究利用大豆种子特异性启动子替换35S启动子构建了新的多基因辅助载体PAUX-2,并在此基础上构建了包含来自小眼虫藻的Δ8去饱和酶基因和来自球等鞭金藻的Δ9链延长酶基因的植物表达载体pCambia2300-Δ8Δ9。为进一步利用转基因技术研究这些基因在植物中的表达提供了条件。

拟南芥AtFAD6基因突变体的构建

运用优化后的CRISPR/Cas9基因编辑载体,创建了2个不同的拟南芥脂肪酸去饱和酶6基因(AtFAD6)突变体,其AtFAD6基因的保守位点氨基酸序列均发生变化,同时终止密码子被提前引入,基因功能丧失。脂肪酸组分分析结果显示,这2种突变体的叶片中单不饱和脂肪酸16∶1和18∶1大量积累,多不饱和脂肪酸16∶3和18∶3含量则大幅下降,同时伴随着叶片发黄、地上部生物量显著降低、抽薹提前2~3 d的表型变化。多不饱和脂肪酸18∶3作为茉莉酸合成的前体物质,其含量的下降致使突变体中茉莉酸信号标记基因AtVSP1在叶片中的表达量有所降低,而茎中的表达量提高了40%以上。所获得的2个AtFAD6功能丧失型突变体为进一步研究脂类代谢与植物生长发育之间的关系提供了重要的遗传材料。

酶促化生产香料

据Haarmann & Reimer公司的有关最新报告,最重要的内酯类食用香料γ-癸内酯的制取方法,现可应用解脂假丝酵母,以蓖麻油的发酵性β-氧化作用来获得。脂肪氧合酶是已知的把不饱和脂肪酸作酶转化成低分子量醛与醇的必需成分,这一酶促化法是生产顺式-3-己烯醇与反式-2-己烯醛的普遍采用的可靠方法。这二种物质具有青鲜的香韵并水果、蔬菜香气。

联合调脂治疗的指南、共识及相关研究进展

目前,他汀类药物被认为是调脂治疗的基石药物,然而,由于一些患者存在他汀类药物禁忌证等,在经他汀单药治疗后仍未能达到理想的血脂水平。而联合调脂治疗,即在他汀类药物的基础上联用1种或多种非他汀类药物,或成为此类患者的治疗新选择。为此,本文对联合调脂治疗最新更新的国际指南和专家共识简要介绍,并概述了近年来联合调脂治疗的临床研究情况,包括他汀类药物联合依折麦布、前蛋白转化酶枯草溶菌素9抑制剂、贝特类药物、ω-3多不饱和脂肪酸的临床试验进展,以期为临床血脂异常的防治提供参考。