蓝猪耳精细胞的分离及两个精细胞群体的收集

蓝猪耳是二细胞型花粉,生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精细胞。用体内-体外技术培养出花粉管后,将其置于爆破液中即可释放出花粉管内含物,其中包括两个精细胞和营养细胞。在显微镜下两个精细胞具二型性:体积较大的精细胞与花粉管的营养核相连,体积较小的精细胞只与大精细胞连接。两个精细胞之间的连接比较结实,需用微量酶液将两个精细胞分开。用显微操作仪就可分别挑选出两个精细胞群体,分别有上百个细胞。蓝猪耳精细胞的成功分离为利用蓝猪耳开展离体受精研究打下了良好的基础。这种单一纯化的精细胞群体的获得为用分子生物学方法区分两个精细胞的特异基因和蛋白质创造了条件。

蓝猪耳卵细胞和合子的分离

蓝猪耳(Toreniafournieri)胚囊部分裸露出胚珠,在光学显微镜下能清楚观察到卵细胞和助细胞的形态结构。用解剖和酶解-解剖两种方法都能分离出生活卵细胞。用前种方法机械分离出的卵细胞数量较少(5%),但避免了酶对配子识别研究的干扰。在后种方法中加入0.1%纤维素酶和0.1%果胶酶既能使分离更加容易操作,又对卵细胞没有致命伤害,能在短时间内分离出较多的卵细胞(18%)。用酶解-解剖方法也可分离出授粉14h后的合子细胞。

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18bp和右边界外234bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.

蓝猪耳再生系统的建立

采用4因子3水平的正交设计,研究外植体种类、NAA、6-BA和光照处理对蓝猪耳愈伤组织诱导的影响,结果表明,光照下带有根的完整植株生长在MS+NAA0.5mg/L+6-BA2mg/L的培养基上能够诱导出大量的愈伤组织。比较了不同外植体在诱导愈伤组织出现的时间、形态、质地和颜色等方面的差别。无菌苗的幼叶在培养基MS+NAA0.1mg/L+6-BA2mg/L中不定芽诱导率最高,达到81.3%,在MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上有效不定芽数最多,在MS+NAA0.1～0.5mg/L培养基中无根的植株能够诱导出大量的不定根。

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化系统的建立

通过对影响根癌农杆菌介导蓝猪耳转化效果各种因素的研究，建立了蓝猪耳高效稳定的遗传转化系统。研究结果表明，农杆菌侵染叶片外植体效率最高；外植体预培养不利于农杆菌的侵染；乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化蓝猪耳的效率。另外，菌液浓度、侵染和共培养的时间及再生的途径等均对转化效率有一定的影响。叶片外植体与农杆菌共培养后，经过抗性芽的诱导、根的再生，70d左右就可以获得抗性苗。抗性植株经GUS染色、PCR分析和Southem blot检测，外源基因已经整合到蓝猪耳基因组中，转化频率为7％-8％。

钙和硼对蓝猪耳花粉萌发及花粉管生长的影响

研究了钙(Ca2+)和硼(H3BO3)对蓝猪耳花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明:(1)在一定范围内Ca2+几乎不影响花粉萌发频率,而主要影响花粉萌发速度和花粉管生长速度;低Ca2+不利于花粉管生长,而高Ca2+抑制花粉萌发速度和花粉管生长;在稍高于最适Ca2+浓度的条件下,花粉管生长早期呈现波浪形。(2)硼明显影响花粉萌发频率及花粉管形态;花粉管生长必需硼,但不同浓度的硼对花粉管生长速度影响不明显;在高浓度硼条件下,较长时间内花粉管均呈现出波浪形。(3)Cooled-CCD动态跟踪观察进一步证实Ca2+影响花粉管生长速度,而硼则不明显。

蓝猪耳受精生物学研究进展

蓝猪耳(Torenia fournieri L.)胚囊半裸露,在光学显微镜下能清楚观察到卵细胞、助细胞及部分中央细胞的形态结构,有助于原位观察卵细胞在受精前后的变化状态,被认为是研究被子植物体内受精机理的一种模式植物。综述了蓝猪耳的受精机理:花粉管定向进入胚囊的方式与机理、钙在受精过程中的作用、受精前后胚囊细胞骨架的动态变化。简要介绍了离体受精技术在蓝猪耳受精生物学中的发展应用。根据前人对蓝猪耳的研究成果并结合我们的研究,指出蓝猪耳在受精生物学中的应用,特别是借助离体受精技术平台,将具有更大的研究前景。

蓝猪耳组织培养和植株再生条件研究

以蓝猪耳(Toreniafournieri)叶片为外植体,研究了离体培养条件过程中多种物理化学因素对蓝猪耳愈伤组织的形成和植株再生的影响,进而筛选出了离体培养的最优条件.

烟草与蓝猪耳胚胎发生中细胞表面三种凝集素受体的动态分布

以异硫氰酸甲酯 (FITC)标记的三种凝集素 (伴刀豆凝集素 ,麦芽凝集素和大豆凝集素 )为荧光探针 ,对烟草及蓝猪耳各发育时期胚细胞表面的凝集素受体进行了定位。结果显示胚柄基部荧光信号最强 ,沿胚柄单列细胞向胚体方向渐次减弱。以后随着胚柄功能的逐渐丧失而改变。同时 ,三种凝集素受体集中分布于胚柄细胞间的分裂面 ;凝集素受体在原胚中分布的另一个特点是聚集于新形成的细胞壁上。随着胚胎发育至分化阶段 ,凝集素受体则主要分布在胚体细胞的外切向壁上 ;

蓝猪耳再生条件优化及不同外植体再生比较

为了寻求一种最佳的蓝猪耳再生体系, 比较了叶片诱芽、诱愈及幼苗生根的几种培养基, 结果表明,1 /2MS+BA1mg/L+NAA0 1mg/L、MS+BA1mg/L+ 2 .4 D0 1mg/L和1 /2MS分别是诱芽、诱愈及生根的最佳培养基。不同外植体诱芽结果显示, 根、茎和叶片都可以诱导不定芽的产生, 但以叶片诱导的效率为最高。几种再生体系比较的结果表明, 蓝猪耳叶片诱芽的再生体系为最佳再生体系。

蓝猪耳胚囊结构观察方法的比较

采用不同显微镜和染料对蓝猪耳(Torenia fournieri Lind.)胚囊结构进行了比较观察。结果表明,Leica DM5000B显微镜和Leica DMI4000B荧光显微镜不适合观察、拍摄胚囊超微结构,Leica DMRXA显微镜基本符合要求,激光共聚焦显微镜效果最好。普通显微镜下即可观察到未染色材料的胚囊,染色后效果更佳。爱氏苏木精染色,胚囊着色浅且不均匀;曙红Y染色,需在荧光显微镜下观察、拍照。荧光染料(DAPI、鬼笔环肽、碘化丙啶和罗丹明)染色后,采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察胚囊结构特征,效果良好。

蓝猪耳叶片高频率再生体系的建立

以蓝猪耳(Torenia fournieri Linden)叶片为外植体,研究多种因素对蓝猪耳不定芽诱导及不定根形成的影响,并进行了条件优化,建立了蓝猪耳叶片高频率离体再生体系.结果表明:芽诱导与基本培养基成分关系不大,而与植物生长物质的浓度和种类有关,其中以MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L状态最佳;不定根形成受到植物生长物质和培养基中离子浓度的共同影响,最佳生根条件为1/2 MS+IBA 0.2 mg/L.

蓝猪耳启动子捕获系统的建立

为了分离基因启动子,构建了陷阱植物表达载体pHAHCA,用农杆菌介导的无启动子GUS方法转化蓝猪耳,经抗性筛选和PCR检测,获得82株转基因植株,转化率达12.5%。12株GUS染色呈阳性,其中10株GUS在叶脉表达,2株在茎和叶脉表达。对转基因植株进行盐胁迫处理,有1株根部出现GUS染色蓝色斑点。通过TAIL-PCR扩增和测序,获得5个T-DNA侧翼序列。

蓝猪耳小孢子发生和雄配子体发育

利用常规石蜡切片和超薄切片技术研究蓝猪耳(Torenia fournieri)小孢子发生和雄配子体发育过程。蓝猪耳雄蕊4枚,花药具4个花粉囊。小孢子母细胞经减数分裂成四分体,其排列方式为四面体形或左右对称形。成熟花粉属2细胞型,具3个萌发孔。花药壁发育为双子叶型,腺质绒毡层。小孢子母细胞在四分体时期频繁出现细胞质降解的异常现象,其它发育阶段均正常;小孢子母细胞不正常的减数分裂可能导致花粉败育,这可能是蓝猪耳结实率低的原因之一。

蓝猪耳的繁殖及其在荆州园林应用的调查分析

以蓝猪耳(Torenia fournieri)为试验材料,研究了近年来其在华中地区(以荆州市为代表)的繁育及园林应用可行性状况。结果表明,蓝猪耳在荆州的生长状态良好,单株花朵数可达147朵左右,花期长达133 d,结实率达到41.89%。通过对荆州市典型小区(油院小区,城南春天,悉尼印象,荆州花园)、重点街道(江津路,北京路)和典型性公共园林绿地(沙隆达广场)的园林植物进行应用性评估,发现当地的园林植物应用存在系列问题,如植物造景材料老化、园林绿化所选用的植物与建筑风格不符以及绿化未能与时俱进等缺陷。采用典型绿地实地考察与模拟应用相结合的形式,对蓝猪耳在荆州园林绿地的应用效果及前景进行了可行性分析。总体而言,蓝猪耳在荆州的园林绿化中可以大规模引进和采用。

蓝猪耳的养护及病虫害防治技术

概述新潮奥运花卉蓝猪耳生产过程中的技术要点。详细介绍蓝猪耳常见病虫害,如苗期猝倒病(立枯病、枯萎病)、枯萎病、叶斑病、丛枝病、白粉病、炭疽病、病毒病、蓟马、蜗牛、红蜘蛛、蚜虫、斑潜蝇、鳞翅目螟类害虫的病征、病状和防治措施。

蓝猪耳花粉萌发和花粉管生长的影响因素

[目的]探讨蓝猪耳花粉管的最佳培养条件,为建立植物离体受精体系奠定基础。[方法]采用离体培养技术,研究了蓝猪耳花粉离体萌发和花粉管体外生长的主要影响因素。[结果]蓝猪耳花粉萌发及花粉管生长的最佳培养基为:5.00%(V/V)蔗糖、0.01%(V/V)氯化钙、0.01%(V/V)硼酸和0.01%(V/V)磷酸二氢钾,其培养基的渗透压主要靠蔗糖调节。[结论]硼是蓝猪耳花粉萌发中必不可少的微量元素;钙对花粉管生长起着非常重要的调节作用,并推测钙离子主要是通过电压依赖型钙通道进入花粉管内部。

蓝猪耳研究进展

由于特殊的花器官结构和开花习性,蓝猪耳成为一种理想的适于进行科学研究的观赏花卉。介绍了蓝猪耳组织培养和遗传转化国内外研究的概况,并详细论述了利用蓝猪耳为材料进行授粉受精机理和花色代谢研究的一些最新成果。

蓝猪耳花粉管细胞壁超微结构的FESEM和AFM比较研究

[目的]比较场发射扫描电镜(FESEM)和原子力显微镜(AFM)观察蓝猪耳花粉管表面形貌和细胞壁中纤维素微纤丝排列的效果。[方法]蓝猪耳花粉离体培养2 h后,利用FESEM和AFM原位观察无损的花粉管表面形貌和细胞壁的精细结构。[结果]FESEM可见花粉管表面粗糙的网状结构;AFM可获得花粉管的三维立体图像,并可见花粉管细胞壁物质的精细结构和纤维素微纤丝的排列情况。[结论]AFM是一种观察花粉管表面结构和细胞壁中纤维素微纤丝排向的有效手段。

转化pCAMBIA1301载体蓝猪耳F_1代植株的花粉育性研究

通过自花和异花授粉、电镜扫描、花粉活力测定等方法,对转pCAMBIA1301基因蓝猪耳的9个转基因株系的F1代植株的育性进行了研究.结果表明：蓝猪耳不存在自交不亲和现象但其转基因植株出现花粉败育;对9个转基因株系进行测定,发现其花粉活力与对照（77.3%）差异显著,仅为9.8%- 30.6%,表明转基因蓝猪耳花粉败育不是由于基因的插入引起的,普通培养基组培瓶蓝猪耳花药活力与在土壤中萌发的蓝猪耳花粉活力均为75%左右,表明组培环境也不是引起花粉败育的原因,因此继代培养基是引起花粉不育的唯一原因.