α-互补与蓝白斑筛选机制的探究

针对高校生物科学实验教学中存在的问题,着重探究了基因重组试验中的α-互补与蓝白斑筛选机制,精心设计了5组试验,结果指出,经双酶切的质粒载体自身不能环化,也不能成功转化;蓝白斑筛选中的蓝斑通常来源于商品载体中的环状质粒或者线性载体自连后的转化产物;重组子一般为白斑,但在一定条件下,白斑也会变成蓝斑。在此基础上作了进一步的讨论,为今后的教学实践和科学研究提供借鉴和指导。

基于项目化学习整合发酵工程和基因工程的复习--以“蓝白斑筛选实验”为例

以“蓝白斑筛选实验”为主线,整合发酵工程和基因工程中的关键技术,在项目化学习过程中通过3个环节帮助学生掌握和理解相关的知识和技术,促进学生生物学学科核心素养的提升。

利用“蓝白斑筛选”高效融合微生物学和基因工程实验

高中生物学选修1、选修3中涉及诸多微生物基础操作实验和基因工程实验,在实际学习过程中,各个实验板块呈现出不同程度的割裂状态。通过蓝白斑筛选实验,可将培养基配制、无菌技术、微生物的培养和分离、转基因技术、基因工程的应用等实验以一个完整的实验贯穿,促使学生知识的学习和能力提升更加系统化、有序化、整体化,同时促进学生全面提升学科素养和综合素养。

盐单胞菌Fosmid文库构建及群体感应淬灭酶的筛选

通过构建盐单胞菌Fosmid基因组文库,以求筛选到群体感应淬灭酶(AHL降解酶)。采用改良的SDSCTAB法提取1株盐单胞菌基因组DNA,经平末端连接、包装和转染后,成功构建盐单胞菌Fosmid基因组文库。该文库库容1 700个克隆,平均插入片段约35 kb,共包含约60 Mb的DNA容量,覆盖该菌基因组10倍以上。然后以加X-gal的MM基本培养基筛选AHL降解酶阳性克隆,对文库进行功能驱动的蓝白斑筛选。通过初筛,筛选到3个Fosmid阳性克隆,证实了所构建的Fosmid基因组文库能够应用于AHL降解酶的活性筛选。同时该Fosmid文库亦可进一步用于其他功能基因的开发。

用PCR技术筛选小分子DNA重组菌落的研究

为解决小分子DNA与质粒载体连接,转化入大肠杆菌后,蓝白斑不能很好鉴别非重组菌落与重组菌落的问题,本实验拟建立用PCR技术快速筛选小分子DNA重组菌落的方法,并对比研究特异引物扩增和通用引物扩增的可靠性。

用组合引物PCR法简便快速筛选阳性正向克隆

PCR扩增的小片段DNA用T载体连接,转化受体菌后观察不到典型的蓝/白斑。用插入片段的特异性引物对菌落进行PCR来筛选阳性正向重组子,测序鉴定结果吻合率达100%,说明当利用颜色特性挑选阳性克隆成为困难时,菌落PCR技术是一种简单、快速、可靠的筛选方法。

在水动力条件下高效聚磷菌除磷特性研究

通过蓝白斑筛选技术从太湖底泥中筛选出11株聚磷菌,进一步筛选出一株高效聚磷菌,命名为G19。经过生理生化分析初步鉴定G19为李斯特氏菌属。研究表明,G19能够在废水合成培养基中较好生长,在TP初始浓度为0.33mg/L,温度为25℃下,经过两天生长,废水合成培养基中TP下降到0.08 mg/L,除磷率高达到75.8%。实验采用自制环形水槽,当水流扰动时形成主流区和回流区,研究G19在主流区和回流区对水体中磷的去除作用,实验表明在回流区存在紊动强度较大时,高效聚磷菌除磷作用明显。试验结果对污水处理及湖泊富营养化治理具有指导意义。

表达兔瘟病毒VP60基因的重组病毒BHV-1的构建与鉴定

为了构建表达兔瘟病毒VP60基因的牛疱疹病毒I型,首先构建含有兔瘟病毒VP60基因和CMV启动子的转移载体,然后将构建移载体与gE基因缺失的牛疱疹病毒I型基因组共转染牛肺细胞后收获增殖的病毒。通过蓝白斑筛选不含有LacZ基因的白色病毒蚀斑,反复纯化获得重组病毒BHV-1-VP60。PCR方法验证VP60基因的成功插入,间接免疫荧光试验和Western blot,结果证明了BHV-1-VP60中的VP60基因在易感细胞中获得了表达。本研究成功地构建了兔瘟病毒VP60基因的重组病毒BHV-1-VP60,为研制新型兔瘟活载体疫苗奠定了基础。

人FcγRⅡB基因cDNA的克隆和序列测定

目的克隆人IgG Fc受体(FcγRⅡB)编码区cDNA序列并测序。方法从人B细胞淋巴瘤Raji细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码FcγRⅡB受体的cDNA序列,PCR产物连接入PUCm-T载体、转化DH5α感受态细胞,蓝白斑筛选阳性克隆,经PCR鉴定并进行DNA序列测定。结果获得预期大小的PCR产物,经正、反双向测序证实PUCm-T载体中插入的FcγRⅡB基因序列与GeneBank(登录号NM-001002274)上编码的相应序列完全一致。结论成功克隆了FcγRⅡB基因,为进一步了解受体功能和作用机制,开展相关疾病的治疗打下了良好基础。

强化生物除磷系统的功能微生物研究进展

人类活动过程中排放的磷是导致水体富营养化的重要原因之一,因此,采取强化生物除磷(Enhanced biological phosphorus removal,EBPR)技术去除污水中磷,减轻对环境不利影响。由于具有经济、可持续的优点,EBPR系统在污水除磷中得到广泛应用,而体系中微生物群落组成合理、功能完整是EBPR系统高效稳定运行的关键所在。为了深入了解EBPR系统除磷机理和实现高效稳定运行,对系统中微生物群落结构和主要功能微生物进行了大量研究。EBPR系统中除了具有聚磷能力的聚磷菌(Polyphosphate-accumulating organisms,PAOs)外,还包括没有聚磷能力的非聚磷菌(non-PAOs),主要为聚糖菌(Glycogen-accumulating organisms,GAOs)和一些辅助细菌等。目前,发现与聚磷相关的功能微生物种类越来越多,研究最多的PAOs和GAOs分别为Accumulibacter和Defluviicoccus。PAOs和GAOs在不同的环境条件下存在竞争或合作关系,但是PAOs在特定条件下是否能够表现出GAOs的代谢特性这一问题还存在争论。除传统碳源、p H和温度等因素影响生物除磷外,外源污染物(如抗生素和重金属)对EBPR系统中功能微生物也产生影响。为了获得高效PAOs,传统分离方法、蓝白斑筛选法和人工构建工程菌的方法先后得到应用。现代分子生物学技术的发展为EBPR系统中功能微生物研究提供了先进可靠的技术手段,通过高效聚磷菌的构建实现高效除磷是未来提高实际污水中生物除磷效率的一个重要发展方向。

T载体构建及其构建过程中常见问题的处理方法

PCR产物与克隆载体连接是基因克隆环节中重要的一步。但是,商品化的T载体价格相对来说比较昂贵。因此,利用实验中剩余的空载体构建T载体,通过对其连接效率进行验证,证明该方法是一种经济有效的办法,可以满足基因克隆的需要。

人类血管内皮生长因子受体VEGF-R3胞外区1-3环cDNA基因的研究

目的 将VEGF-R3(FIT-4)基因片断插入克隆载体并进行分子生物学鉴定,对肿瘤细胞通过淋巴管转移到局部淋巴结的机制进行研究.方法 用T-A克隆的方法 将RT-PCR产物克隆入质粒载体PGEM-T Easy,转染大肠杆菌JM109,进行蓝白斑筛选,获取重组体单酶切电泳图谱.结果 经过RT-PCR扩增,得到VEGF-R3的cDNA,琼脂糖凝胶电泳显示为一条带,经蓝白斑筛选获得基因VEGF-R3的白色克隆,重组质粒单酶切电泳结果 与预期结果 一致.结论 RT-PCR产物可采用T-A克隆,获得的阳性重组体可用于进一步基因表达及基因治疗等研究.

P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达

目的分别将人类p100基因，p100的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒，使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达，从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础。方法PCR分别扩增出P100蛋白全长，SN片段和TD片段基因的序列，定向克隆至真核表达载体pERFP-CI，构建相应的3种重组质粒。将构建成功的质粒转染入HeLa细胞，荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达。结果①PCR法获得P100基因序列，长度为2659bp，SN基因片段1918bp，TD基因片段741bp；②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段，将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段；③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达。结论3种外源片段成功载人pERFP-CI质粒；P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。