蓝舌病毒1型灭活疫苗的制备与免疫效果

比较了二乙烯亚胺(BEI)、甲醛和β-丙内酯(BPL)3种灭活剂对蓝舌病毒1型(BTV-1)的灭活效果,利用免疫印迹法检测灭活病毒蛋白,选择BEI作为疫苗灭活剂制备BTV-1灭活疫苗并免疫绵羊,通过竞争ELISA法和噬斑减少中和试验(PRNT)测定抗体效价评价疫苗免疫效果。结果显示,BEI、BPL和甲醛均能在48 h内完全灭活BTV-1,且在BPL和BEI灭活处理的病毒样品中均可以检测到VP6、VP7、NS1和NS2四种病毒蛋白,而在甲醛处理的病毒样品中仅检测到了VP7蛋白,表明BEI和BPL在灭活病毒过程中对病毒蛋白抗原影响较小。血清抗体检测显示,与对照组相比,疫苗免疫组绵羊血清中抗BTV非中和抗体和中和抗体均显著升高。本研究制备的BTV-1灭活疫苗具有很好的免疫原性,这也为研制其他血清型蓝舌病疫苗奠定了基础。

蓝舌病毒1型VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为了研制蓝舌病新型亚单位疫苗,将蓝舌病毒1型(BTV1)VP2基因克隆到pFastBacHTB载体中,得到重组转座载体pVP2,并转化至DH10Bac感受态细胞,获得了重组杆粒rVP2。然后采用脂质体转染法转染Sf9昆虫细胞,通过克隆筛选获得重组杆状病毒。SDS-PAGE分析结果显示,获得了约110ku的表达产物,与预期结果相符。Western-blot结果显示,目的蛋白能被BTV1感染的山羊阳性血清识别。结果表明,经杆状病毒体系表达的可溶性重组VP2蛋白具有良好的反应原性,为进行蓝舌病新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。

应用噬菌体展示7肽文库技术进行蓝舌病1型病毒VP2蛋白表(拟)位分析

为了对蓝舌病1型病毒(BTV1)VP2蛋白表位进行定位,本研究利用BTV1型特异性抗体淘选噬菌体展示的7肽随机肽库,进行VP2蛋白表(拟)位分析。对筛选获得共有序列噬菌体,采用ELISA和竞争性ELISA分析不同噬菌体拟位与BTV1型特异性抗体的免疫反应性,结果显示含有TTPNNLS基序的噬菌体拟位能够与BTV1型特异性抗体发生特异性结合,并且该结合能够被BTV1抑制或阻断,表明拟位多肽真实模拟病毒蛋白上与BTV1型特异性抗体结合的抗原决定簇或表位。本研究揭示了BTV1 VP2蛋白的865THPNKCLVA873位氨基酸构成BTV1 VP2蛋白特异性表位,为该病的免疫机理研究奠定了基础。

蓝舌病病毒血清Ⅰ型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型(BTV1)主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDualBTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验(IFA)检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和r BacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。

蓝舌病Ⅰ型病毒VP5蛋白的表达纯化及免疫原性分析

为分析蓝舌病Ⅰ型病毒(BTV-1)VP5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组VP5蛋白相对分子质量约为62 kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现IPTG为0.2 mmol/L、温度为25℃、诱导6 h时,重组蛋白在上清中表达量最高,通过Ni柱纯化获得的重组蛋白纯度约为75%。将纯化后的重组蛋白VP5分别以40μg/只和20μg/只免疫Balb/c小鼠,同时设置PBS为阴性对照,对三免后血清进行间接ELISA检测,发现高、低剂量免疫小鼠均能产生针对VP5蛋白的特异性抗体。用灭活BTV-1进行DOT-ELISA检测,发现其能与VP5蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应,说明利用大肠杆菌表达的重组蛋白VP5具有良好的免疫特性,这为进一步开展BTV相关研究奠定了基础。