蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10。Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/κ链。Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应。利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546。本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础。

血清15与21型蓝舌病病毒的分离与鉴定

【目的】蓝舌病病毒是一种重要的虫媒病毒,血清型较多,为了解近年来江苏省盱眙县蓝舌病病毒流行情况及血清型分别情况。【方法】本研究于2015-2016年在盱眙县桂五镇建立了5头蓝舌病血清学阴性山羊作为监控动物群。从2015年5-10月,每周采血1次,2015年11月至2016年4月,每月采血1次,用BTV C-ELISA试剂盒进行血清学监测。用RT-PCR检测转阳前2周、1周和转阳本周的血液样品,选择阳性样品处理后接种鸡胚,收获死亡鸡胚肝脏,用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏,上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21 3代进行病毒分离。阳性样品采用RT-PCR进行血清型鉴定。【结果】6月开始部分动物血清抗体转阳性,至12月,监控动物全部转为阳性。通过鸡胚、细胞传代培养共获得5个出现细胞病变的细胞培养物,经RT-PCR检测VP7基因均扩增出1156 bp片段。进一步通过RT-PCR检测VP2基因对5个分离毒株进行血清型鉴定。结果表明2株为BTV-15、3株为BTV-21。【结论】上述结果丰富了江苏省蓝舌病的流行病学资料,为蓝舌病的防控提供科学依据。

蓝舌病病毒血清1型野毒株及疫苗株S10基因差异

蓝舌病病毒血清型 1型是主要致病血清型之一。为明确其流行规律的分子生物学基础 ,采用 RT- PCR扩增和序列测定技术分析了 15株野毒株及 1株弱毒疫苗株的 S10全基因片段 ,并对其核苷酸和氨基酸差异进行了比较。所有毒株 S10基因核苷酸长度均为 82 2 bp,含有 2个起始密码子 (核苷酸 2 0～ 2 2和 5 9～ 6 1)和 1个终止子 (核苷酸 70 7～70 9) ,预测编码 2种蛋白 (NS3和 NS3A)。不同毒株间 S10基因核苷酸差异为 0～ 138个 (同源性 10 0 %～ 82 %) ,NS3/NS3A蛋白氨基酸差异为 0～ 15个 (同源性 10 0 %～ 93%)。基于 S10基因序列分析 ,可将蓝舌病病毒野毒株及疫苗株分为 2个基因群 :12株野毒株及 1株疫苗株为基因 群 ,3株野毒株与澳大利亚 型毒株属于基因 群 ,两群间的核苷酸同源性为 79%。各基因群在地域分布及宿主来源上未发现有明显的特征性。基因群与毒株分离年代、对 BHK- 2 1细胞毒力等特征关系亦不明显。

云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析

2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(BTV-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BTV-7型毒株并掌握其遗传特征。作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、BHK-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细胞上的感染特性,采用高通量测序获取分离毒株的全基因组序列,通过qRT-PCR与血清中和试验对哨兵牛血液中的病毒核酸与中和抗体变化进行回溯分析。结果表明:2020年5月,分离到1株能引起BHK-21细胞发生细胞病变的病毒(毒株号V303/YNJH/2020),经鉴定为BTV-7型。分离毒株的基因组全长19154 bp(GenBank收录号MW046280至MW046289),与广东省2014年分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,基因节段1至6,基因节段9与10的核酸与编码蛋白氨基酸序列(nt/aa)相似度分别大于98%、99%;V303/YNJH/2020毒株的基因的节段7和基因节段8属Western地域型,与广东GDST008毒株对应基因节段的nt/aa序列相似度仅为71.5%/81.6%、79.6/%84.4%。病毒蚀斑与增殖曲线比较显示,V303/YNJH/2020在BHK-21细胞的增殖能力明显强于GDST008。回溯分析显示,感染V303/YNJH/2020的哨兵牛未出现临床症状,血液中的病毒核酸持续存在长达12周;在病毒感染后第4~9周,血液中的中和抗体滴度水平维持在1∶256。云南省2020年分离的BTV-7型V303/YNJH/2020毒株与广东省分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,在BHK-21细胞上的增殖能力强于GDST008毒株;V303/YNJH/2020虽未引起感染动物的临床症状,但病毒核酸与中和抗体在感染动物血液中长时间存在。研究结果为开展BTV-7型在我国的演化规律、病毒变异以及致病性等方面的研究奠定了基础。

蓝芩口服液联合利巴韦林气雾剂对手足口病患儿症状恢复时间及病毒转阴率的影响

目的探讨蓝芩口服液联合利巴韦林气雾剂对手足口病患儿症状恢复时间及病毒转阴率的影响。方法选取2021年7月至2023年6月聊城市第二人民医院收治的96例手足口病患儿作为研究对象,按随机数字表法将其分为对照组(48例)和观察组(48例)。对照组采用利巴韦林气雾剂治疗,观察组在对照组基础上采用蓝芩口服液治疗,两组均治疗2周。比较两组临床疗效、症状恢复时间、血清免疫球蛋白水平与病毒转阴率。结果观察组临床总有效率高于对照组,症状恢复时间及住院时间均短于对照组,观察组治疗后免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)水平高于对照组,观察组肠道病毒转阴率与人肠道病毒71型(EV71)病毒转阴率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在利巴韦林气雾剂基础上给予蓝芩口服液治疗能够显著提高临床疗效,快速缓解临床症状,改善免疫球蛋白水平,提升病毒转阴率。

蓝舌病病毒血清9型毒株在我国的首次分离

旨在分离流行于我国云南省的蓝舌病病毒(BTV),掌握分离BTV的遗传特征与感染特性。采用"鸡胚—C6/36细胞—BHK-21细胞"接种的方式,采集哨兵牛的BTV阳性血液进行病毒分离;采用血清中和试验以及Segment 2与Segment 6ORF区的克隆测序确定分离病毒的血清型;通过病毒噬斑形成和增殖曲线的测定,分析病毒在BHK-21细胞的增殖特性;通过qRT-PCR与血清中和试验分析BTV感染动物血液中病毒含量与中和抗体动态变化情况。结果显示:2013年8月,在云南芒市设定的哨兵牛中分离出一株BTV(毒株号V013/YN/2013),血清中和试验显示V013/YN/2013为BTV-9型病毒,Segment 2与Segment 6序列分析表明分离的病毒属BTV-9Eastern型,与日本毒株和澳大利亚BTV-9型毒株具有最近的亲缘关系。病毒噬斑与增殖曲线测定结果显示V013/YN/2013在BHK-21细胞上增殖能力明显强于BTV-9型参考毒株。自然感染V013/YN/2013的牛在连续5个月的监控期内未出现临床症状,感染动物虽产生了特异性中和抗体,但血液中始终能持续检测到病毒核酸。本研究首次报道了BTV-9Eastern型毒株V013/YN/2013在我国的分离,为进一步开展中国BTV-9型病毒的全基因组测序、诊断方法的建立、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。

中国蓝舌病病毒血清15型毒株的全基因组测序与进化分析

【目的】获取中国蓝舌病病毒血清15型(BTV-15)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。【方法】通过全长c DNA扩增与高通量测序技术获取中国1996年分离的BTV-15型毒株B105/YN/1996的全基因组序列,进行序列比对并构建系统发生树。【结果】序列分析结果显示:B105/YN/1996毒株基因组全长19 154 bp,各基因节段长度在822 bp (Seg-10)~3 944 bp (Seg-1)之间,编码蛋白大小在216 (NS3a蛋白)~1 302 (VP1蛋白)个氨基酸残基之间。B105/YN/1996毒株的Seg-1、-2、-3、-4、-6与澳大利亚2012年分离BTV-15型毒株的对应基因节段之间具有最近的亲缘关系,Seg-7、-8、-9、-10则与中国BTV-15型V447毒株、BTV-4型YTS4毒株和BTV-1型Y863毒株的序列相似度最高;Seg-5与印度BTV-1型毒株IND1992/02具有最近的亲缘关系。在构建的系统发生树上,B105/YN/1996毒株的Seg-2与Seg-6归属于东方型,Seg-3与Seg-4则构成独立远东型;Seg-7、-10分别构成独立东方-1与东方-2型。【结论】中国BTV-15型毒株B105/YN/1996的不同基因节段在遗传进化上呈现高度多样性的特点,提示该毒株为基因重配毒株;该毒株的Seg-3、-4、-7、-10形成了独特的地域型,提示中国BTV-15型毒株在进化上的特殊性。

蓝舌病病毒血清8型定性传入风险评估

2006年8月荷兰暴发的蓝舌病8型(BTV-8)疫情已蔓延至欧洲大陆,而国内目前尚未发现BTV-8感染的报道。为评估BTV-8传入国内的风险,采用定性评估方法,通过收集BTV-8疫源地国家的疫情信息数据,结合其病原学特征、传播媒介、分布及流行情况、传染源、传播途径和易感动物等方面的研究内容进行传入风险分析。鉴于我国与欧洲BTV-8疫源地各国的畜产品贸易以及活动物、精液和胚胎交易频繁,贸易数量巨大,而且BTV-8还可以通过家养动物与野生动物接触以及库蠓等媒介传播,综合分析认为BTV-8传入国内的风险较高。建议加强边境口岸检验检疫,以及牛羊等反刍动物及库蠓的BTV-8监测,防范BTV-8传入国内,并做到传入时早发现、早控制。

蓝舌病病毒7型毒株的分离与分子鉴定

为监测广东省蓝舌病流行状况,2014年从广东省某一奶牛场采集血液样品,检测虫媒病病原,对经RTPCR检测蓝舌病病毒核酸阳性的样品进行病毒分离并鉴定。经鸡胚静脉接种后取肝,研磨后离心取上清转接C6/36细胞和BHK-21细胞,出现CPE,RT-PCR检测蓝舌病病毒的VP7基因并进行序列比对,电镜观察病毒粒子,证实分离到蓝舌病病毒,命名为GD/ST2014。进一步扩增VP2基因,进行系统发育树分析,以及血清中和试验,表明此分离株为血清型7型。这是国内首次报道牛源蓝舌病病毒血清型7型的分离鉴定。

2009年西安地区手足口病病原血清型分析及肠道病毒71型基因特征

目的了解西安地区2009年手足口病的肠道病毒血清型;评价IgM抗体检测在肠道病毒71(EV71)感染早期诊断中的意义;分析西安地区EV71 VP1基因特征。方法分别在西安市城区医院和郊县医院采集的标本共185份,RT-PCR法检测标本中的病毒核酸;采集EV71核酸阳性的急性期病例血液标本,ELISA法检测血清中IgM抗体;细胞培养分离EV71,扩增其VP1区,测序并与EV71各血清型代表株序列比对,进行进化分析。结果在185份标本中,156份检出肠道病毒核酸(84.32%),其中72.4%为EV71,17.3%为柯萨奇A16(CA16);63份EV71核酸阳性的急性期病例血清标本中,45份EV71 IgM抗体阳性(71.43%);分离到的12株EV71均为C4亚型。结论 2009年西安地区手足口病病原以EV71为主,且主要是C4亚型;ELISA方法可用于EV71感染的早期诊断。

蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备蓝舌病病毒03TV）8型VP2蛋白的单克隆抗体（MAb）TL鉴定其抗原表位，本研究采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达并纯化的重组VP2蛋白免疫BALB／c小鼠，三免后取小鼠脾淋巴细胞与SP2／0细胞进行融合，并以纯化的重组VP2蛋白为包被抗原，通过间接ELISA筛选出两株能够稳定分泌抗BTV8VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株（2G4和387）。间接免疫荧光结果表明：2G4和387与BTV8均呈阳性反应，与BTV1～7、BTV9-24、茨城病毒、中山病毒以及赤羽病毒均呈阴性反应。Westernblot结果显示，2G4和387均能够识别BTV8及BTV8重组VP2蛋白。Ig亚类鉴定2G4和387均为IgG1／κ链。利用原核表达的96条覆盖VP2全长的麦芽糖结合蛋白（MBP）融合短肽对MAbs的抗原表位进行鉴定，结果表明：MAb2G4识别的抗原表位为捌LCRLLSTIGRKMCNTE^296。本研究结果为BTV8型特异性检测方法的建立及VP2蛋白结构和功能的研究奠定了基础。

浙江省甲型病毒性肝炎血清流行病学研究

甲型肝炎是由甲型肝炎病毒引起的,以肝实质细胞炎性损伤为主的世界性传染病,各国的甲肝抗体水平差异明显.1992年全国开展了病毒性肝炎的血清流行病学研究,至今已十余年,为及时掌握甲肝抗体各地区、年龄组等分布情况,与1992年流调结果相比较,找出变化规律,提出甲肝预防策略,2001年我们对浙江省人群甲肝流行情况进行分析,现将结果报告如下.

血清8型蓝舌病病毒侵入北欧

蓝舌病是由蓝舌病病毒感染引起的、库蠓传播的一种严重威胁绵羊和山羊的传染病，在世界许多地方都有流行。牛是贮存宿主，但通常不发病。已知的蓝舌病病毒分为24个血清型。以前，蓝舌病病毒几乎没有在欧洲出现过，但在1998年以后．陆续有几个血清型从土耳其和中东入侵希腊、意大利、西班牙、葡萄牙以及巴尔干半岛的国家。

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的血清学分型研究

本文运用气管环血清中和试验对１２个ＩＢＶ毒株进行了血清型研究。以气管环纤毛运动为指示系统，以能中和２．０ｌｏｇ１０ＣＤ５０同源病毒血清效价为１个抗体单位，含２０个抗体单位的血清与等量病毒作用测定血清对纤毛运动保护百分率，以欧氏距离数字分类分型，并用ＳＰＳＳ软件聚类分型分析。结果表明ＳＡＩＢ１属Ｍ４１型，ＳＡＩＢ３属Ｔ型；ＸＪＩＢ接近Ｍ４１型，ＳＨＩＢ、ＳＡＩＢ２接近Ｔ型。ＸＪＩＢ，ＳＨＩＢ，ＳＡＩＢ２具有过渡性（变异性）特征。

蓝舌病病毒3型VP5蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备血清3型蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用pMAL-C4x原核表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,并以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗BTV3 VP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(3F2)。间接免疫荧光结果表明:MAb 3F2与BTV3、BTV5、BTV9、BTV16呈阳性反应;与BTV6、BTV7、BTV13、BTV21呈弱阳性反应;与其它BTV血清型均呈阴性反应。利用原核表达的麦芽糖结合蛋白(MBP)融合短肽对MAb 3F2识别的抗原表位进行鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为89PGERGIQMKIKEIEEE104。氨基酸序列比对结果显示该表位在不同地域来源的BTV3株间比较保守。该MAb的制备和鉴定为进一步研究VP5蛋白的结构和功能奠定了基础。

赣榆县儿童肠道病毒71型血清流行病学调查

目的:了解赣榆县儿童肠道病毒71型(HEV71)抗体水平及自然感染状况,为预防控制儿童手足口病传播与流行提供依据。方法:2010年8月采集赣榆县2个乡镇400名1～15岁儿童、20名新生儿与其母血清标本,采用中和试验方法检测血清的HEV71中和抗体。结果:420名儿童中HEV71中和抗体阳性178人,阳性率为42.4%。阳性率与年龄有关,5月龄的儿童阳性率最低,随着年龄的增长,抗体阳性率及几何平均滴度先下降后上升,HEV71中和抗体几何平均滴度水平为1∶15.05,各年龄组间抗体阳性率、几何抗体平均滴度差异均有统计学意义;不同性别间儿童、高低发乡镇间儿童、新生儿与母亲间抗体阳性率、几何抗体平均滴度差异均无统计学意义。结论:赣榆县<3岁儿童是目前手足口病防控的重点人群。儿童在4～5月龄时是接种EV71疫苗的最佳时机。

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离株的血清分型研究

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离株的血清分型研究姜北宇郑世兰白丽萍刘月焕景小冬姚颖（北京市农林科学院畜牧兽医研究所１０００８１）鸡传染性支气管炎（ＩＢ）是由病毒引起的一种急性、高度接触性呼吸道及泌尿生殖道疾病。鸡感染鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）后，表现...

蓝舌病病毒血清Ⅰ型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型(BTV1)主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDualBTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验(IFA)检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和r BacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。

应用噬菌体展示7肽文库技术进行蓝舌病1型病毒VP2蛋白表(拟)位分析

为了对蓝舌病1型病毒(BTV1)VP2蛋白表位进行定位,本研究利用BTV1型特异性抗体淘选噬菌体展示的7肽随机肽库,进行VP2蛋白表(拟)位分析。对筛选获得共有序列噬菌体,采用ELISA和竞争性ELISA分析不同噬菌体拟位与BTV1型特异性抗体的免疫反应性,结果显示含有TTPNNLS基序的噬菌体拟位能够与BTV1型特异性抗体发生特异性结合,并且该结合能够被BTV1抑制或阻断,表明拟位多肽真实模拟病毒蛋白上与BTV1型特异性抗体结合的抗原决定簇或表位。本研究揭示了BTV1 VP2蛋白的865THPNKCLVA873位氨基酸构成BTV1 VP2蛋白特异性表位,为该病的免疫机理研究奠定了基础。

蓝舌病病毒8型可视化RT-LAMP检测方法的建立

为建立蓝舌病病毒8型(BTV-8)可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据BTV-8外衣壳蛋白(VP2)基因保守序列设计2对BTV-8血清型特异性引物,通过反应条件优化建立了BTV-8可视化RT-LAMP检测方法。该方法最佳反应条件为60℃1 h;利用本实验建立的方法检测BTV-8,以及其它23个血清型BTV以及口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒和狂犬病病毒,结果显示除BTV-8外,该方法与其它病原无交叉反应,特异性较强;该方法最低可检测到8.3×10-10 ng/μL的病毒RNA,敏感性是OIE标准套式RT-PCR检测方法的10倍,敏感性较高。应用建立的RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法对38份牛羊临床样品进行检测,两种方法检测结果一致均为阴性。本研究建立的BTV-8可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速和高通量检测的优点,为BTV-8的可视化快速检测提供可行方法。