蓝舌病病毒VP7蛋白的B细胞表位预测

根据前期试验中测得的蓝舌病病毒VP7蛋白的基因序列和推导的氨基酸序列，利用DNAStar软件和Biosun软件进行生物信息学预测，以单参数（亲水性、可及性、柔韧性、抗原性）预测为基础，结合二级结构预测来综合分析蓝舌病病毒VP7蛋白的B细胞表位。比较两种软件的预测结果发现，在蓝舌病病毒VP7蛋白的381个氨基酸序列中，第81～85、198～202、235～239、253～257区域有较好的亲水性、表面可及性和较高的抗原指数，并且在二级结构上含有易形成抗原袁位的转角和无规则卷曲，最有可能为蓝舌病病毒VP7蛋白的B细胞线性优势表位。上述预测和判定结果表明，在蓝舌病病毒VP7蛋白序列中存在优势B细胞线型表位，为进一步合成多肽并分析已获得的VP7蛋白单抗的结合表位奠定了基础。

两种培养条件下重组杆状病毒表达蓝舌病病毒VP7蛋白的丰度研究

为了在重组杆状病毒上获得高丰度表达的蓝舌病病毒(BTV)VP7蛋白,利用细胞贴壁培养和摇瓶培养法培养重组杆状病毒,培养5 d,每天采集培养液,用ELISA方法检测其中BTV VP7蛋白的表达量,用SPSS软件对数据进行统计分析。结果显示,贴壁培养条件下BTV VP7蛋白的表达量显著高于摇瓶培养,两种培养条件下BTV VP7蛋白均在第三天时表达量最高,之后开始下降。研究表明用杆状病毒昆虫细胞系统表达BTV VP7蛋白时更适合用贴壁培养方法进行大规模表达。

蓝舌病病毒VP7蛋白竞争抑制群特异性构象抗原表位的初步鉴定

为鉴定蓝舌病病毒（BTV）的单克隆抗体（MAb）所识别的VP7蛋白竞争抑制群特异性构象抗原表位，本研究采用噬菌体展示技术对BTVVP7蛋白构象抗原表位氨基酸进行筛选，通过质粒定点突变技术对编码筛选获得的氨基酸区域的基因进行突变，同时利用ELISA法验证该氨基酸区域突变后对BTVvP7蛋白抗原性的影响。结果表明被BTVMAb4H7所识别的BTVVP7蛋白竞争抑制群特异性构象抗原表位由175FQG177、185YL186和278WH279组成，其中aal75～aal77和aal85～aal86为该抗原表位的关键性氨基酸，本研究初步阐明了BTvVP7蛋白竞争抑制特异性的分子基础，对VP7蛋白功能研究和建立BTV群特异性检测方法具有重要意义。

蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。

蓝舌病病毒VP7抗原在重组杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

本试验通过在重组杆状病毒表达系统中制备、纯化与鉴定蓝舌病病毒VP7抗原,为开发蓝舌病病毒免疫学抗体检测方法提供科学依据。利用SignalP与TMHMM在线软件分析VP7序列的信号肽与跨膜疏水区序列,对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成后的核苷酸序列连接至pFastBacHTA载体上,并构建相应的重组杆粒Bacmid-VP7-DH10Bac,转染sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒Bacmid-BTV-VP7株,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达制备蓝舌病病毒VP7抗原。结果显示,重组杆粒Bacmid-VP7-DH10Bac转染sf9昆虫细胞并连续盲传5代后,成功获得重组杆状病毒Bacmid-BTV-VP7株,并成功表达纯化出VP7蛋白,大小约为43 kDa,蛋白纯度约为94%;VP7重组蛋白与其他疫病抗体无非特异性交叉。综上,重组VP7蛋白能够与BTV阳性血清呈现特异性反应,具有良好的反应原性,蛋白纯度高,并且具有病毒蛋白的生物学活性,将其作为诊断抗原,后期可用于开发系列免疫学抗体诊断检测技术。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

免疫共沉淀联合质谱技术筛选蓝舌病病毒NS4蛋白的互作蛋白

[目的]筛选蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)NS4蛋白颉颃干扰素(interferon, IFN)信号通路的内源性互作蛋白,以便进一步研究NS4抑制IFN信号转导的作用机制。[方法]在前期仙台病毒(Sendai virus, SeV)诱导IFN信号通路基因表达研究基础上,利用免疫共沉淀方法从转染NS4融合eGFP标签表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP和pcDNA3.1-eGFP空载体的HEK-293T细胞中钓取NS4互作蛋白,对免疫沉淀物进行SDS-PAGE分析,免疫共沉淀洗脱液进行质谱鉴定及生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白的编码基因表达特征。[结果]通过免疫共沉淀及质谱鉴定分析和数据库比对,共获得189个差异表达蛋白。生物信息学分析结果显示,候选蛋白主要参与蛋白转录、翻译、病毒感染及免疫调控。亚细胞定位分析结果显示,差异表达蛋白主要定位于细胞核、细胞质以及胞质-胞核,筛选出4个与BTV NS4蛋白存在互作的候选蛋白:多聚嘧啶束结合蛋白1(PTBP1)、细胞周期依赖性蛋白激酶9(CDK9)、N-端豆蔻酰化酶1(NMT1)和Y盒结合蛋白1(YBX1)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,SeV刺激72 h后,试验组PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9基因mRNA表达量均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01)。[结论]BTV NS4蛋白颉颃IFN信号通路与PTBP1、NMT1、YBX1、CDK9蛋白表达上调有关,本试验结果为进一步研究BTV NS4蛋白颉颃宿主天然免疫应答的分子机制提供靶标参考。

柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

肠道病毒C组96型VP1蛋白线性B细胞表位筛选与鉴定

目的鉴定肠道病毒C组96型(enterovirus C96,EV-C96)VP1蛋白的线性B细胞表位。方法采用IEDB网站提供的在线分析工具分析、预测EV-C96 VP1蛋白的线性B细胞表位,结合其二级结构、β-转角、抗原性、亲水性等多项参数,筛选出优势候选表位;应用间接ELISA法检测候选表位与EV-C96免疫血清的反应性以及与21种其他常见手足口病病原血清的交叉反应性;应用微量中和试验测定表位抗体的中和效价;采用序列比对分析表位的序列保守性;应用结构对齐分析表位的结构特异性。结果通过生物信息学筛选出EVC96 VP1蛋白7个候选表位(P1~P7);ELISA法检测发现P7(氨基酸序列位置为282~304)与EV-C96多克隆抗体有强反应性,与其他常见EV多克隆抗体不发生明显反应;微量中和试验显示,P7抗体的中和效价低于1∶2;序列及结构分析结果显示,P7的氨基酸序列在EV-C96型内具有较高保守性,与其他EV相应位点氨基酸序列的结构有明显差异。结论P7表位为EV-C96特异的非中和性B细胞表位,可作为开发EV-C96检测试剂盒的候选抗原表位。

蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。

蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10。Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/κ链。Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应。利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546。本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础。

抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb)。并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株(1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4和4D12)。Western blot结果显示,MAb 1F6、2B1、2D10、3B6、3D9与BTV8 VP7蛋白反应,MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应。间接免疫荧光结果显示,该8株MAb与24型BTV血清型呈不同的反应谱系。本研究所获得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究提供了实验依据。

蓝舌病1型病毒VP7蛋白表(拟)位定位及免疫检测分析

为研究蓝舌病1型病毒VP7蛋白关键性氨基酸表位定位,本试验应用抗蓝舌病1型病毒VP7蛋白单克隆抗体淘选噬菌体展示的7肽随机肽库,对筛选的共有序列噬菌体扩增纯化,通过ELISA、竞争性ELISA分析共有噬菌体拟位与蓝舌1型病毒VP7蛋白单克隆抗体的免疫反应性。结果表明,含有LNWPMVR基序的噬菌体拟位能够与蓝舌病1型病毒VP7蛋白单克隆抗体发生特异性结合,并且此结合能被蓝舌病1型病毒抑制或阻断,表明噬菌体7肽模拟了BTV蛋白上与蓝舌病1型病毒VP7蛋白单克隆抗体结合的抗原决定簇,提示蓝舌病病毒VP7蛋白的第163-189位氨基酸(LNAGARGDVQQIFQGRNDPMMIYLVWR)构成蓝舌病病毒VP7蛋白特异性表位。

蓝舌病病毒VP_7蛋白的B细胞表位预测

根据前期试验中测得的蓝舌病病毒VP7蛋白的基因序列和推导的氨基酸序列,利用DNAStar软件和Biosun软件进行生物信息学预测,以单参数（亲水性、可及性、柔韧性、抗原性）预测为基础,结合二级结构预测来综合分析蓝舌病病毒VP7蛋白的B细胞表位。

14型蓝舌病病毒VP7蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立蓝舌病(bluetongue,BT)的血清学诊断方法,本研究通过得到14型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的s7基因,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,原核表达得到VP7蛋白,并对表达的包涵体VP7蛋白进行纯化,Western blot分析表明,纯化的VP7蛋白具有良好的抗原性。以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。该方法与羊痘阳性血清,羊口蹄疫阳性血清和羊的小反刍兽疫阳性血清均无交叉反应,与中和试验比较,两者符合率为90%,ELISA批内和批间重复性试验显示,D值的变异系数小于10%。说明本方法具有良好的特异性和重复性。本研究在国内首次建立了14型BTV抗体间接ELISA方法,可用于BTV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测,为以后相关BTV ELISA检测试剂盒研发提供技术平台。

抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型BTV(BTV1)免疫BALB/c鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4和4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。同时,IFA鉴定结果进一步表明,3株MAb与24个血清型的BTV均可以发生反应。本研究制备的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。

蓝舌病病毒VP7蛋白的可溶性纯化及多克隆抗体的制备

首先参照GenBank中已发表的基因序列人工合成蓝舌病病毒VP7基因,将其克隆到表达载体pSMK上。选取含有正确开放阅读框的重组质粒pSMK-VP7,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于16℃利用IPTG诱导剂进行诱导表达,优化表达条件,纯化重组VP7蛋白,免疫新西兰白兔制备VP7多克隆抗体,利用免疫印迹试验对制备的多克隆抗体进行特异性分析。结果显示,重组VP7蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,且16 h表达量最大,利用镍离子树脂纯化获得了高纯度的VP7蛋白;原核表达的重组VP7以及天然的VP7蛋白均能够与VP7多克隆抗体发生特异性反应。本研究成功实现了重组BTV VP7蛋白的可溶性表达和纯化,并制备了特异性良好的多克隆抗体,为进一步开展BTV的VP7功能研究和建立BTV诊断方法奠定了基础。

利用生物条形码技术对蓝舌病毒VP7蛋白进行微量检测

目的:建立高灵敏检测蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测方法。方法:制备VP7蛋白的多抗及特异DNA链标记的金纳米颗粒探针(NP)和VP7蛋白单抗标记的磁性微球探针(MMP),形成MMP-VP7蛋白-NP三明治复合物后,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过PCR或芯片检测方法鉴定释放的DNA链,确定VP7蛋白的存在。结果:建立了蓝舌病毒VP7蛋白的生物条形码检测体系,检测灵敏度可达10fg/mL,为常规ELISA检测的106倍。结论:为发展高灵敏度的蓝舌病毒生物条形码检测试剂盒鉴定了基础。

蓝舌病病毒NS4蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)NS4蛋白多克隆抗体,为BTV NS 4基因在病毒增殖及颉颃宿主细胞天然免疫应答中的作用研究奠定基础。【方法】构建pCzn1-NS4原核表达载体,经PCR和测序鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,使用His标签镍柱纯化NS4蛋白,并经SDS-PAGE、Western blotting鉴定。利用NS4蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经SDS-PAGE和间接ELISA法测定多克隆抗体纯度及效价,以制备的NS4蛋白多克隆抗体为一抗,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测BTV感染的BHK-21细胞内NS4蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达质粒pCzn1-NS4,在37℃、IPTG浓度为0.6 mmol/L时诱导8 h获得大量NS4重组蛋白,SDS-PAGE及Western blotting试验结果显示,重组蛋白分子质量约为18 ku,可与兔His-tag抗体发生特异性反应;制备的NS4蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上。经SDS-PAGE和IFA鉴定,制备的BTV NS4多克隆抗体具有良好的纯度,且在BTV感染的BHK-21细胞中能特异性识别病毒表达的NS4蛋白。【结论】本研究利用原核表达的NS4蛋白制备了特异性多克隆抗体,并初步将该多克隆抗体用于NS4蛋白免疫荧光试验研究,为BTV NS 4基因的功能和应用研究提供参考依据。

传染性法氏囊病病毒新型变异株VP2蛋白原核表达及免疫效果评价

【目的】构建传染性法氏囊病病毒新型变异株(vaIBDV)VP2蛋白原核表达质粒,并明确VP2蛋白的免疫原性,为vaIBDV亚单位疫苗的开发提供技术支持。【方法】从IBDV新型变异株(BZ)中扩增VP2基因片段,亚克隆至pET-28a(+)载体上构建重组原核表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定,并以vaIBDV阳性血清进行琼扩效价测定;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,制备乳化疫苗并免疫21日龄SPF鸡,通过安全性检验、抗体效价测定及攻毒保护评价进一步验证融合蛋白VP2的免疫原性。【结果】在25℃下以IPTG进行诱导表达,获得的融合蛋白VP2主要呈可溶性表达,大小约40 kD,且表达上清液中的融合蛋白VP2能与vaIBDV阳性血清发生特异性反应,其琼扩效价可达1∶32;经Ni-NTA亲和层析纯化及适当浓缩后,融合蛋白VP2的琼扩效价高达1∶256。以融合蛋白VP2为抗原制备的亚单位疫苗稳定性好,安全性高,无免疫引起的不良反应,剖检也未发现接种部位有明显损伤、局部炎症或疫苗吸收不良等现象。免疫21 d后鸡血清琼扩效价平均值达1∶76.8,而血清抗体效价均在1∶20000以上,表明以融合蛋白VP2制备的疫苗可刺激机体产生强烈的体液免疫反应,抗体阳性率达100%;使用IBDV BZ株攻毒后7 d剖检观察鸡法氏囊病变情况,结果显示免疫组鸡只均未发病,其法氏囊也无明显萎缩现象,即免疫保护率达100%。【结论】通过原核表达系统能成功实现vaIBDV VP2蛋白的可溶性表达,且获得的融合蛋白VP2免疫原性良好,能对vaIBDV提供100%的免疫保护效果,为开发vaIBDV亚单位疫苗提供了技术支持。