蓝色犁头霉原生质体的制备与再生

研究了氢化可的松生产菌蓝色犁头霉原生质体的形成与再生。通过对溶解酶系统的选择 ,影响原生质体形成的因素如渗透压稳定剂、酶浓度、菌龄、菌丝培养基和培养方式等因素进行考察 ,发现以 0 .4mol/LNH4 Cl做为稳定剂、2 .5mg/mL溶壁酶和 5mg/mL纤维素酶组成的混合酶液溶解菌丝 ,4h后原生质体量可达 10 6 cell/mL。通过显微镜观察原生质体的形成过程以及在高渗培养基上的再生情况 ,再生率为 15 .6%。

从蓝色犁头霉中提取壳聚糖

报道了一种从蓝色犁头霉菌丝体细胞壁中提取壳聚精的简便方法。经72h发酵，壳聚糖产量占菌丝体干重的11．72％。纯度为89．36％，游离氨基为92．13％，1％壳聚糖的1％醋酸溶液粘度为230MPa·s，平均分子量为3×105，灰分为8．62％，水分为3．78％。

蓝色犁头霉深层发酵产壳低聚糖生长动力学研究

目的:研究蓝色犁头霉产壳低聚糖分批发酵动力学的模型。方法:在10L发酵罐中,将蓝色犁头霉分批发酵培养,对蓝色犁头霉菌丝体生长、产物形成和基质消耗的实验数据进行分析,根据Logistic和Luedeking-Piret方程分别建立蓝色犁头霉发酵过程菌体生长、壳低聚糖生成和基质消耗的动力学数学模型,并利用1stOpt软件对模型参数进行非线性曲线拟合。结果:研究得到了菌体生长、产物合成及基质消耗的动力学模型及参数,模型的拟合度分别为0.994、0.986、0.992。结论:研究表明蓝色犁头霉多糖合成和菌体生长呈生长偶联型,模型计算值与实验值有良好的拟合性,模型准确度较高。

加压介质对蓝色犁头霉孢子存活率及甾体转化的影响

分别以N2、高纯空气[V(O2):V(N2)=21:79]和CO2为加压介质,研究高压条件下蓝色犁头霉孢子存活率的变化情况。在3种不同加压介质下,蓝色犁头霉孢子存活率显示出相同的变化规律,随压力升高,孢子存活率逐步降低;压力一定时,蓝色犁头霉孢子存活率随保压时间的延长而降低;在相同压力和保压时间下,蓝色犁头霉孢子在高纯空气中的存活率明显高于在N2和CO2中的孢子存活率,其中蓝色犁头霉孢子在CO2中的存活率始终低于其他两种加压介质;在适宜的压力和加压介质条件下,压力可显著提高蓝色犁头霉氢化可的松产量。

从蓝色犁头霉中提取壳聚糖的初步研究

报道了一种从蓝色犁头霉细胞壁中提取壳聚糖的简便方法．经７２ｈ摇瓶培养，在１００℃下、５％ＮａＯＨ间歇处理二次，２％ＨＣＬ抽提１２ｈ，天然壳聚糖产量占菌丝干重的１１．７２％，脱乙酰基制备的壳聚糖产量占菌丝体干重的２．５８％．

利用廉价原料培养蓝色犁头霉生产壳聚糖的研究

本研究利用犁头属真菌蓝色犁头霉发酵生产壳聚糖,探索了廉价并能高产壳聚糖的液态发酵培养基配方。通过对比农副产品对菌丝体产率的影响,最终确定出最佳的培养基组份为:糖蜜8%,棉籽壳20%,硫酸铵1%。得到菌丝干重为17.3g/L,粗壳聚糖为1.4g/L,通过检测得到该产品脱乙酰度为84.47%,纯度为79.5%。

蓝色犁头霉JY-2^#的选育与发酵特性

将经过紫外线诱变的蓝色犁头霉原生质体倾注于含有化合物RSA(17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯)的高渗再生培养基平板上,选育具有RSA抗性的氢化可的松生产菌株。获得60株抗性突变株,其中8株突变株的氢化可的松转化率高于出发菌株。突变株JY-2#的氢化可的松转化率达81.63%,较出发菌株提高了14.1%。初步研究了突变株JY-2#在5 L发酵罐的转化工艺和转化反应动力学。

蓝色犁头霉发酵法制备甲壳素和壳聚糖的研究

对以犁头霉发酵法制备甲壳素和壳聚糖的工艺条件进行了研究,优化出较佳的工艺条件和方法,并进行了培养基和发酵条件的单因素与正交试验,结果表明:蓝色犁头霉较佳培养基组成为:蔗糖2.5%,牛肉膏1.2%,K2HPO40.075%,生物素0.0003%;其较优发酵条件为:温度25℃,周期48h,pH6.0,瓶装液量75mL/250mL。但蓝色犁头霉发酵法制备甲壳素及壳聚糖的产量不高,与用化学法相比并不经济,要实现工业化生产,尚需寻找新菌种或采用基因工程、诱变育种等手段以制造出高产甲壳素和壳聚糖的遗传性状稳定的工程菌。

甲壳素脱乙酰酶产生菌的筛选及产酶条件

采用固体平板培养和液体发酵筛选产生甲壳素脱乙酰酶的真菌,并且研究了产酶条件.结果显示在42株真菌中有26株有甲壳素脱乙酰酶活性,最终确定了构巢曲霉和蓝色犁头霉两株产酶活性较高的菌株,它们产生的酶活性分别是343U·mL-1和289 U·mL-1.不同的菌株的产酶培养基中的碳源均为含乙酰基的碳源,最适氮源分别为酵母粉和蛋白胨,产酶能力都受Mn2+和Co2+促进,受Cu2+、Fe2+、Fe3+的抑制;构巢曲霉的最适温度、最适pH分别为29 ℃,7.0～7.5,蓝色犁头霉的最适温度、最适pH分别为31 ℃,6.5～7.0,最适发酵时间均为96 h.

甾体微生物转化C_(11)β-羟基化的研究进展

C11β-羟基化是甾体微生物转化中难以实现的一步反应。对甾体C11β-羟基化的机理及部分生理生化问题进行了讨论,对蓝色犁头霉和新月弯孢霉催化转化甾体C11β-羟基化的应用研究特点及其催化转化反应产物氢化可的松的工业生产现状及相关问题进行了评述,并对此技术开发前景进行了预测。

三种真菌对洋地黄毒苷的生物转化特性研究

考察了新月弯孢霉(Curvularia lunata)AS3.3589、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)CICC40302和雷斯青霉(Penicillium raistrickii)ATCC10490对洋地黄毒苷的生物转化特性.结果表明:新月弯孢霉AS3.3589转化洋地黄毒苷得到2个产物,即产物Ⅰ和产物Ⅱ,产物Ⅰ的转化率为27%,产物Ⅱ的转化率为5%;蓝色犁头霉CICC40302转化洋地黄毒苷得到1个产物,即产物Ⅲ,转化率为6%;雷斯青霉ATCC10490对洋地黄毒苷不发生转化反应.通过优化新月弯孢霉KA-91生物转化反应的工艺条件,使转化产物Ⅰ的转化率达到38%,产物Ⅱ的转化率达到10%.

双菌多轮序列协同转化甾体制氢化可的松

建立了蓝色犁头霉AS 3.65和新月弯孢霉AS 3.4381协同多轮转化17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)制氢化可的松(hydrocortisone,HC)新工艺。在培养好的AS 3.65和AS 3.4381所组成的协同转化体系中,AS 3.65首先将RSA水解为脱氧皮质酮(RS),这较AS 3.4381单轮批次转化省去了RSA到RS的化学水解工序。在甾体底物RSA平均投料质量浓度为1.3 g/L和1 g/L的条件下,所选定的协同转化体系可分别被重复利用3轮和6轮,相应的平均产率能维持在较高水平,分别高达81.6%和85%。另外,该工艺明显减少了底物RSA投料浓度对C11位羟化的影响,并有效抑制了AS 3.4381和AS 3.65单独转化过程中出现的14α-OH-RS和11α-OH-RS副产物。

壳低聚糖高产菌的诱变选育

[目的]探讨壳低聚糖高产菌诱变选育的方法。[方法]以壳低聚糖产生菌蓝色犁头霉ZH08为出发菌株,经紫外诱变和亚硝酸诱变处理,以对硝基乙酰苯胺为指示剂,利用双层平板颜色反应法,挑取菌落黄色比较深的脱乙酰酶高活性突变株,再经摇瓶发酵复筛,以获得壳低聚糖产量较高的菌株。[结果]通过对出发菌株ZH08进行理化诱变,获得突变株共7株(XH01～07),经过反复传代和筛选,这几株突变株的壳低聚糖含量均高于出发菌株,其中XH05菌株的壳低聚糖含量最高,其产量稳定在1.07 g/L,比出发菌株提高72.6%。[结论]利用对硝基乙酰苯胺作为筛选具较高甲壳素脱乙酰酶酶活的跟踪试剂,用于筛选壳低聚糖高产菌株,是一种快速、有效的筛选方法。

改进底物添加体系制备氢化可的松

在蓝色梨头霉和新月弯孢霉协同转化制备氢化可的松(HC)过程中,常规的底物热溶液体系由17α羟基孕甾4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)和乙醇组成,其中m(RSA)∶V(乙醇)=1∶25;改进后的底物溶液体系由Tween-80、丙三醇、RSA和磷酸盐缓冲溶液(PBS)组成,其中V(Tween-80)∶V(丙三醇)∶m(RSA)∶V(PBS)=1∶3∶1∶25。RSA质量浓度从2g/L起,累加到5g/L,RSA全部被转化,且产物氢化可的松(HC)产率与常规低浓度投料相当;在RSA质量浓度3g/L时添加底物,协同菌丝体能重复利用达3次,HC产率稳定在70%左右;经3批次实验室摇瓶放大制备实验,产物HC平均收率为52%,重现性较好,工艺操作稳定。Tween-80/丙三醇/RSA/PBS底物体系较常规RSA/乙醇构成的底物添加体系,可显著提高HC生产收率,有工业应用价值。

甾体11β-羟基生物转化新工艺的研究

通过分析 11β-羟基转化体系中反应介质和发酵液的影响 ,设计了一种将化合物 RS- 2 1醋酸酯转化为氢化可的松的新工艺。确定工艺条件为 :孢子接种浓度 1× 10 6/ m L ,2 8℃ ,摇床转速 (150～ 170 ) r/ min,培养 (17～ 2 1) h,培养液 p H值降至 3.8、菌体处于稳定期前期、菌丝干重达 7.2 mg/m L以上时 ,以 1∶ 1稀释比稀释 ,投料转化 2 4 h,β体转化率达 (75～ 76 ) %。

真菌接合孢子囊的形成及特征观察实验的改进探索

真菌接合孢子囊的形成及特征观察是微生物学实验教学内容之一。采用蓝色犁头霉＂＋＂和＂-＂菌株为实验菌种（取代以往常用的匍枝根霉）,并以＂八＂字型划线接种,同时拍摄了该菌种形成接合孢子囊的5个生长阶段典型特征的显微镜照片用于实验教学,不但减轻了以往匍枝根霉孢囊孢子等易污染实验室环境的现象,也避免了该菌种对培养温度较敏感、常易引起实验结果不理想的状况。同时使学生知识学得更活、更扎实,并对培养学生创新意识也具有一定的指导意义,因而提高了该实验教学的效果,受到学生的欢迎。

β-环糊精对甾体微生物转化菌种生长特性的影响

研究了β-环糊精(简称β-CD)对两种甾体生物转化菌种蓝色犁头霉(Absidia coerulea)和分枝杆菌(Myco- bacterium sp．)生长特性的影响。采用以β-CD作为唯一碳源的固体培养法和添加有β-CD的液体培养法,分别观察菌种对β-CD的利用以及β-CD对菌体生长过程和生物量的影响。结果表明,两种菌种均不能利用β-CD;在培养液内添加不同量的β-CD或在菌体生长的不同时期添加一定量的β-CD均不影响菌种的生长特性。

HP-β-CD对脂质体和真核细胞通透性的影响

以薄膜水化法制备的阴离子脂质体的平均粒径为(180±2.3)nm,Zeta电位为–33.9,mV.分别以脂质体中钙黄绿素的泄露量和紫外分光光度法测定蛋白含量,以表征羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)对脂质体和真核微生物蓝色犁头霉(Absidia coerulea)细胞通透性的影响.结果表明:在HP-β-CD作用下,两者的通透性变化趋势一致.分析比较HP-β-CD作用下的甾体化合物17,а,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮(RS)在脂质体和菌体细胞中的通量变化的相关性,表明脂质体与细胞通量变化的拟合度达到97.9%,相关性显著(P<0.05).由此说明,本研究建立的脂质体制备方法以及获得的脂质体能够模拟真核细胞,应用于真核微生物的生物学研究.

复合诱变选育氢化可的松高转化率菌株

蓝色犁头霉(Absidia coerulea)是转化17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(RSA)生成氢化可的松(简称HC)的生产菌株。因保藏菌种退化,为了进一步提高HC生产水平,对保藏菌株分离纯化后,利用常压室温等离子体诱变(简称ARTP)和ARTP-LiCl复合诱变的方法对一株蓝色犁头霉进行了诱变。建立了以菌落形态为标准的初筛方法,选取培养6 d后菌落颜色较深、背面呈环状纹路、菌丝较密集的菌株进行HC转化复筛,得到一株遗传稳定性较好的菌株AL-172,RSA浓度为3.5 g/L时,HC转化率达72.52%,底物投料浓度和HC转化率较实验室保藏菌株分别提高了40%和16.20%,具有良好的应用前景。

甾体微生物转化:糖皮质激素氢化可的松生物转化的鲁棒性及其研究应用

结合作者所在实验室半个世纪从事的甾体微生物转化研究,聚焦国内外仅次于抗生素制药的甾体激素药物中的糖皮质激素药物氢化可的松(hydrokotisone,HC)生物转化研发过程,应用工业微生物鲁棒性理论,结合国内外HC半合成路线,评述工业生物转化产生HC的研究进展,特别是该过程所使用的2株具有较高鲁棒性、可以直接实现向甾体底物Reichstein’s化合物S(RS/RSA)引入C11β-羟基的丝状真菌,新月弯孢霉(Curvularia lunata)AS 3.4381和蓝色犁头霉(Absidia orchidis)AS 3.65的研究情况.本实验室近20年的研究重现了新月弯孢霉60%的HC得率的国外报道水平,具有在国内替换低效率蓝色犁头霉AS3.65工艺路线的可行性;8个研发案例充分说明提高我国糖皮质激素HC工业生产水平,无论是改良菌株,还是改进生物转化工艺的开发应用,实现微生物甾体转化工业的经济性鲁棒性是可行的.